[发明专利]海藻酸盐的超纯化方法

说明书

说明书

本发明涉及用于海藻酸盐超纯化的方法，具体地，本发明涉及用于人细胞移植中的微囊化。所述方法有利地适用于药品级海藻酸钠起始粉末的纯化、内毒素和内原性热原的去除以及保持产物的分子结构不发生改变。

技术现状

海藻酸钠(AG)是一种从一些沿太平洋西海岸生长的海藻，特别是巨藻(Macrocystis pyrifera)，中提取的多糖，其广泛应用于包括生物技术在内的多个领域中。生物聚合物盐类的纯化是本发明的主题，它们是从活植物体中自发渗出或从活植物体中提取的水溶性多糖。事实上，海藻酸盐是海藻酸的盐，其表现出D-甘露糖醛酸(-M-)和L-古罗糖醛酸(-G-)单元的共聚物结构。这些单元构成了聚合物或二聚物嵌段MM或GG，它们有时在分子图(molecular pattern)中交替出现。

海藻酸盐的分子排列和组成主要取决于获得它们的来源。例如，最常用的海藻酸盐来源于褐海藻，具体地说，来源于巨藻(Macrocystis pyrifera)的产物的M/G比等于1.56∶1，而来源于北方海带(Laminaria Hyperborea)的产物的M/G比等于0.45。海藻酸盐的一价盐(Na、K)通常是水溶性的，这与以凝胶或固体形式存在的二价盐(Ba、Ca)或多价盐(Fe、Al)不同。

AG已在食品和药品行业中使用多年，分别用于生产果冻和某些种类药物(例如，抗酸剂等)的赋形剂。然而，对于特定应用，例如人类移植中的应用来说，可商购的海藻酸钠并未得到充分纯化，在这些应用中要求严格并且需要(符合)国际认可的质量控制标准，例如，卫生部(the Ministry of Health)的指导方针或美国药典(U.S.Pharmacopeia)的指导方针。

海藻酸盐可以作为待纯化的粗提物或作为部分纯化的溶液商购得到。根据组分(F_G或F_M)和M/G比说明了海藻酸盐粉末的化学组成。例如，产品AG KELTONE LVCR的内毒素水平范围为约30,000EU/g至约60,000EU/g，这样，就使得它不适合用于要求内毒素水平不超过100EU/g(尽管优选更低水平)的肠胃外应用。

因此，在可以肠胃外使用AG KELTONE LVCR前，必须显著降低内毒素水平。

将AG用于制备包含杂交瘤细胞的微胶囊从而用于生产单克隆抗体(Damon Biotech，Inc.)和用于保护胰岛(脑岛)移植不受宿主排异反应的影响已经超过20年(美国专利第483092号)。在患有糖尿病啮齿动物和高等哺乳动物的第一微胶囊移植试验规程中明确强调了所使用材料的纯度是移植本身成功的基础。可能造成微胶囊移植失败的主要污染物有细菌脂多糖内毒素、存在于革兰氏阴性细菌膜中的热原性物质。这些物质耐受大多数灭菌系统(例如，高压灭菌锅)。诸如γ辐照或干热灭菌法的技术能够破坏内毒素，但也会损害需要进行灭菌的材料或产品。此外，它们分子量通常较小(10-20kd)而不能通过标准过滤法去除。无论如何，为了避免二次污染的风险，应考虑获得无菌并且不含内毒素的产品的需要。最后，通过肠胃外引入人体的物质中的内毒素含量必须低于100EU/g，尽管优选低于50EU/g的水平。在使用AG制备用于移植的包含胰岛的微胶囊的情况下，内毒素的存在会使胶囊所提供的免疫保护失效，并促使发生严重的炎症反应。

在过去几年中，对获得超纯化产物(实际上是“不含内毒素”)的需求促进了一些纯化方法的发展，然而，它们仍不能满足所有的工业和安全需要。一些纯化方法设计使用加入或未加入多粘菌素-b的离子交换树脂或通过醋酸纤维素过滤器进行过滤并进一步进行膜透析，其缺点在于：内毒素水平没有相对降低(约70-80E.U./g)，由于原始产物大量损失而造成成本过高并且不适用于大量的AG生产，其在临床使用方案开始时实际上是必不可少的，以及在使用氯仿的情况下表现出难以去除所述溶剂，即使是使用适度的量也具有潜在毒性。例如，在使用AG乙醇沉淀并随后用氯仿提取的技术中，为了获得1升最终产物，需要使用约10升AG作为起始材料。此外，产物的低产率表示不同AG批次可能具有不均匀的特征，这显然不适合用于制备在临床方案中使用的产品，因此大规模可重复的技术是必要的。

美国专利第6451772号以粗海藻酸盐起始，基本上提供了通过聚丙烯过滤器过滤(和/或使用离子交换树脂)并随后用有机溶剂沉淀滤液。该方法的主要限制有：

1、相对于所生产的海藻酸盐的最终体积得率来说，材料成本过高，得率仍不能使人满意，