[发明专利]猪副嗜血杆菌平板凝集检测试剂盒

说明书

1.技术领域  本发明属于兽医学免疫诊断学技术领域，具体是关于一种猪副嗜血杆菌的检测试剂盒，用于猪副嗜血杆菌的鉴定及猪副嗜血杆菌病的诊断。

2.背景技术  猪副嗜血杆菌病是由猪副嗜血杆菌引起的一种传染病。随着世界养猪业的发展，该病已成为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性疾病。

目前检测猪副嗜血杆菌的主要方法包括细菌培养、生化鉴定和PCR。生化鉴定是利用化学或生物化学方法检测细菌的代谢产物鉴定细菌属、种，但该法操作繁琐、检验时间长；PCR方法高度灵敏、快速、简单，但仪器昂贵，不适合基层使用。猪副嗜血杆菌按Kieletein-Rapp-Gabrielson(KRG)血清分型方法，至少可分为15个血清型，部分菌株不能分型。由于猪副嗜血杆菌的血清型众多，不同血清型间缺乏交叉反应，目前还没有针对猪副嗜血杆菌所有血清型通用的血清学检测方法。发明人研制出一种多价血清，通过平板凝集试验即可检测15个血清型和绝大部分未定型猪副嗜血杆菌。具有特异、方便、准确的优点，无需特殊设备，特别适于现场诊断，具有较大的应用前景。

3.发明内容  本发明采用15个血清型的猪副嗜血杆菌制备免疫原免疫健康家兔，分别制备高免血清，通过不同血清型组合，并吸附去除非特异凝集素，筛选出5种血清型组合制备多价诊断血清，装配成试剂盒，能特异性地检测全部15个血清型的猪副嗜血杆菌和绝大多数未定型菌株，可用于猪副嗜血杆菌的检测。

4.具体实施方式

1)制备猪副嗜血杆菌高免血清分别将15个血清型的参考菌株复苏，增菌培养，灭活，加入福氏完全佐剂和不完全佐剂疫苗，常规方法免疫健康家兔，待高免血清平板凝集价达到1∶200以上时采血，分离血清，即为猪副嗜血杆菌高免血清。

2)多价血清组合的筛选分别将不同血清型高免血清混合，评价其检测效果，结果发现血清4型、5型、12型、13型、14型5价混合血清的特异性和检出率最好，为本发明的最佳配伍。

3)非特异性反应的消除多价血清分别用大肠杆菌、沙门氏菌吸附处理，除去其非特异性反应成分，结果显示多价血清只与猪副嗜血杆菌发生特异性凝集反应，不与大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜炎放线杆菌、空肠弯曲杆菌、链球菌等发生非特异性反应。

4)试剂盒的组装将5种高免血清按一定配比混合制成多价诊断血清，并配备其他相关试剂，组装成猪副嗜血杆菌平板凝集检测试剂盒，于2℃-8℃保存。

实施例

实施例1：质量控制

在每次使用检测试剂盒前应作下列质量控制检测

1)检测试剂的控制：取1滴多价血清和1滴生理盐水在载玻片上混匀，静置2min，轻摇玻片，观察是否会出现凝集，如果出现凝集反应，表明多价血清或生理盐水受到污染，应废弃处理。

2)阳性对照的控制：滴1滴猪副嗜血杆菌抗原和1滴多价血清于载玻片同一个测试反应环内，用接种环在整个区域内混匀液体，静置20s观察结果。如果未出现凝集反应，应采用新鲜的检测试剂盒。

实施例2：平板凝集试验检测猪副嗜血杆菌

1)取10μl生理盐水于载玻片的一个反应环内。

2)用接种环从含5％小牛血清和0.01％NAD的TSA平板上挑取可疑菌落适量，与反应环内的生理盐水混合。

3)轻摇检测板2分钟，观察是否会出现自凝集现象。如果菌悬液保持均匀状态，继续第4步。

4)取10μl多价血清于载玻片上，用接种环从TSA平板上挑取适量可疑菌落与多价诊血清混合均匀。

5)在20s内观察并记录结果。

6)若在20s内出现凝集，则判为猪副嗜血杆菌阳性，如不出现凝集，则为猪副嗜血杆菌阴性。