[发明专利]利用原生质体再生技术进行食用菌菌种复壮和脱毒的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及细胞工程范畴，具体的说是一种利用原生质体再生技术进行食用菌菌种复壮和脱毒的方法。

背景技术：

目前，我国栽培的食用菌品种多是通过自然选育的，许多食用菌的性状不稳定，而且容易退化、老化，使得这些食用菌品种的优质性状很难长久保持，且更易受到病毒病的危害。因此，目前迫切需要一种新的食用菌复壮和脱毒技术，不但使食用菌保持其优质性状，而且恢复较好的抗病毒能力。

发明内容：

本发明旨在解决背景技术存在的上述问题，而提供一种利用原生质体再生技术进行食用菌菌种复壮和脱毒的方法，包括：以直接去除细胞壁进而达到去除细胞抑制因子，实现细胞活力恢复的原生质体制备方法；从大量的原生质体细胞中筛选出细胞活性最强的菌株的原生质体再生方法。

本发明采用的技术方案是：一种利用原生质体再生技术进行食用菌菌种复壮和脱毒的方法，按如下步骤进行：

A.亲本选择：

易退化和感染病毒病的常年栽培的食用菌品种，其退化菌株症状为：菌丝生长缓慢无力，稀疏或成束，发育不均匀，菌丝发黄，菌种内出现杂色斑点或不规则形的颗粒状物；其病毒病症状为：菌柄膨大呈近球形或烧瓶形，不形成菌盖或只形成很小的菌盖；

B.原生质体制备：

a.选择浓度为0.6mol/L的甘露醇为稳渗剂；

b.选择蜗牛酶、几丁质酶、纤维素酶或溶壁酶为细胞壁降解酶，浓度为2％；

c.选择酶解时间0.5h～3.5h，酶解温度30℃～40℃；

C.原生质体再生：

a.选择PSA液体培养基为预培养基；

b.培养方法：采用液体转固体培养基培养法，在PSA培养基中预培养原生质体12h，然后再在PSA固体培养基上培养，直到有菌落产生；

b.培养方法：采用液体转固体培养基培养法或者直接固体培养，优选液体转固体培养基培养法；

D.建立食用菌复壮和脱毒菌株的评定标准：

以原生质体再生菌株与未处理菌株的生长、发育和病毒携带率的比较，建立包括食用菌处理前和处理后在菌丝生长速度、出菇时间、产量、品质和病毒检出率比对的食用菌复壮和脱毒菌株的评定标准。

本发明所述原生质体制备步骤中：稳渗剂溶质优选甘露醇，目的在于原生质体的得率较高，且再生率较高；稳渗剂浓度优选0.6mol/L，目的在于此浓度最适于原生质体的释放和保存；细胞壁降解酶优选溶壁酶，目的在于获得最高的原生质体释放；溶壁酶浓度优选2％，目的在于可以实现最优的细胞壁降解；酶解时间优选2.5h，目的在于此时间原生质体达到了最大的释放数量；酶解温度优选35℃，目的在于此温度原生质体达到了最大的释放数量。

本发明所述原生质体再生步骤中：预培养培养基优选PSA，目的在于获得最优的再生率；培养方法优选液体转固体培养基培养法，目的是获得较高的再生率。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)建立了食用菌的原生质体制备和再生技术体系。

(2)所获得的再生菌株农艺性状优良，以平菇89为代表，经过试验和区试表明，它具有以下特征：

①菌丝生长速度快，出菇时间早，原基形成时间早3-6天；

②高产，经过原生质体复壮和脱毒菌株其产量比原种P89等增产60-80％；

③抗杂菌能力较强，遇毛霉，根霉，曲霉及青霉能与其竞争生长，并盖过杂菌；

④病毒检出率低，病毒检出率较复壮和脱毒前少约90％；

⑤栽培基质的利用率高，经过原生质体复壮和脱毒菌株基质利用较快；

⑥子实体品质高，活性成分含量高。

具体实施方式：

以下介绍的是作为本发明内容的具体实施例，并通过实施例对本发明的内容作进一步的阐述。当然，这不应该理解为本发明的前述主体范围仅限于实施例。

实施例1：

白灵菇白10原生质体复壮和脱毒菌株，具体方法如下：

1.亲本选择：平菇89是生产上常年栽培的食用菌品种，但是易退化。退化菌丝生长缓慢，稀疏或成束，发育不均匀，菌丝发黄，菌种内出现杂色斑点或不规则形的颗粒状物。蘑菇产量降低，易感染病虫害。

2.原生质体制备：

以0.6mol/L的甘露醇、2％的溶壁酶为细胞壁降解液，在35℃条件下处P89的液体培养菌丝2.5h，过滤、离心收集原生质体，血小球计数板镜检原生质体数目。

3.原生质体再生：

在PSA培养基中预培养原生质体12h，然后再在PSA固体培养基上培养，直到有菌落产生。