[发明专利]一种金铁锁毛状根系的诱导与培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用生物技术诱导与培养毛状根系的方法，特别设计一种金铁锁状根系的诱导与培养方法。

背景技术

金铁锁是石竹科金铁锁属单种属植物(Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu)，为西南地区特有植物、民间常用草药。其根入药，常用于跌扑损伤、风湿痹痛、胃寒痛、疮疖、创伤出血。是我国中成药保密品种“云南白药”的重要成分之一，也是多种知名中成药的主要成份，如云南白药系列、云南红药胶囊、贵州金骨莲胶囊、福建痛血康胶囊等。近年来随其药用需求量的不断增加，加上自然环境因素和人为作用，使金铁锁资源数量急剧下降，目前已作为珍稀濒危物种列入《中国植物红皮书》中，属于国家二级重点保护植物。

随着生物工程技术的发展，利用发根农杆菌诱导药用植物产生毛状根，并对毛状根进行离体扩增培养，可以快速大量的提取植物体中有效化学成分，也是进行药用植物资源可持续发展的有效途径之一。由于毛状根具有生长速度快、分枝多、弱向地性，处于器官化水平，激素自养，生理生化、遗传特征稳定，有稳定的次生代谢物质合成能力，并且毛状根培养不受环境、生态、气候等条件的限制。因此，利用毛状根培养技术标准化生产金铁锁替代野生资源，不但可以缓解日益增长的市场需求，而且有利于保护、抢救和挖掘民族药，解决日益严重的生态环保问题，也将会大大促进金铁锁等民族药的现代化发展。因此，建立金铁锁毛状根培养系统大量生产金铁锁替代原材料具有重要意义

目前，用发根农杆菌诱导形成的植物毛状根涉及到31科100余种双子叶植物，而露水草(Cyanotis arachnoidea C.B.Clarke)是迄今单子叶植物中毛状根诱导成功的唯一例子。毛状根培养与传统栽培获得中草药原材料相比具有如下优点：(1)毛状根中染色体和次生代谢产物的生物合成相对稳定；(2)毛状根不仅生长速度快，而且次生代谢产物含量高，(3)不受病虫害、地理和季节等各种环境因素的影响；(4)所获得的产物可从培养体系内直接提取，并快速、高效的回收与利用，简化了分离与纯化的步骤；(5)有利于细胞筛选、生物转化，合成新的有效成分；(6)有利于研究植物的代谢途径，还可以利用某些基因工程手段探索与创造新的合成路线，得到价值更高的产品；(7)节省大量用于种植原料的农田。正是由于毛状根的上述优点，为其工业化、规模化生产优质中草药原材料提供了基础，成为继组织培养、细胞培养之后当代生物技术领域重要的研究和开发热点。

利用植物毛状根进行天然产物的生产进入了一个崭新的发展阶段，植物细胞培养技术生产的次生代谢产物被人类广泛应用。通过毛状根培养可以生产的次生代谢产物有生物碱类(如莨菪烷生物碱、喹啉生物碱)、甙类、黄酮类、醌类和一些重要的酶(如超氧化物歧化酶)等。人参毛状根的生长速度是常规激素诱导根生长速度的2倍(Yochikawa，1987)；莨菪毛状根无性系合成莨菪碱的效率是原植物的2倍以上(Mano 1986)；刘春超和刘本叶等对青蒿毛状根的培养条件和代谢组学进行了研究；研究发现栝楼毛状根生产天花粉蛋白克鲜重含量到8.16毫克。这些研究充分表明，毛状根培养体系正在成为生产次生代谢产物的重要生物技术之一。

发明内容

本发明的目的是公开一种金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法.

本发明金铁锁毛状根系诱导与培养方法为：

取金铁锁幼嫩茎为外植体进行脱分化处理，获得新鲜金铁锁愈伤组织，将愈伤组织与含有Ri质粒的发根农杆菌(ACCC10060，保藏单位缩写和菌种编号)共培养，以无菌纸吸取多余菌液后转入到诱导培养基中诱导培养，在金铁锁愈伤组织处生长出金铁锁毛状根；抑菌培养后将具有毛状根的外植体放入扩增培养基中进行毛状根的扩大培养。