[发明专利]一种花生过敏原标准物的制备方法与应用

说明书

技术领域

一种花生过敏原标准物的制备方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术

花生相对其它食品过敏而言，它们的过敏发生率较高、临床症状更为严重，在公共卫生 和食品安全领域倍受人们的关注。

花生是世界粮农组织(FAO，1995)认定的八大类食物过敏原之一，属于八大类容易引起 过敏的食品之首。相对其它食物过敏而言，花生过敏发生率较高、临床症状更为严重，且不 容易随年龄的增长而产生免疫耐受，在公共卫生和食品安全领域倍受人们的关注。研究花生 过敏原检测与控制，必需首先获得高纯度的过敏原组分，它可以为更细致地了解过敏原的生 化特性及各种加工过程对其致敏性的影响提供实验材料，从而有助于低过敏或无过敏的花生 制品的研究以及花生过敏原的检测。南昌大学张英坤(2007)在其硕士毕业论文《抗花生过 敏原Arah2多克隆抗体的制备及其应用》中介绍了一种制备Arah2花生过敏原的方法，他以 四粒红花生为实验对象，经粉碎、脱脂、蛋白抽提、阴离子交换层析、SDS-PAGE电泳回收， 得到了电泳纯(纯度＞95％)的Arah2纯品。但由于只包括了Arah2，未包括过敏原Arah1， 其中公布的方法不能同时制备得到同时包含Arah1及Arah2的过敏原。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是提供一种花生过敏原标准物的制备方法及其应用，用于食 品过敏原检测。

为解决上述问题，本发明的技术方案为：

所述花生过敏原标准物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)脱脂

花生种子脱皮后在液氮中破碎成粉，丙酮脱脂，按照花生粉末质量：丙酮体积为1∶10 (W/V)进行室温振荡萃取1h(小时)，4℃，5000r/m离心10min，弃上清，氮吹10min， 得到脱脂花生蛋白粉，4℃保存；

(2)浸提

按照重量体积比1∶10(W/V)，将花生蛋白脱脂粉溶解在4℃预冷2h的1.0mol/L，pH7.0 的磷酸缓冲液(含0.2mol/L的氯化钠)中，同时加入等体积的0.01mol/L β-巯基乙醇和0.5g/L 乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)溶液混合浸提，4℃下静置过夜。然后浸提液在4℃16000r/m 离心10min后取上清，沉淀用各自的浸提液继续抽提4h，离心后合并上清液，即为花生蛋白 浸提液；

(3)饱和硫酸铵溶液分级沉淀

饱和度30％的硫酸铵溶液的制备，称取硫酸铵(AR)35g，以50-80℃的超纯水100mL溶解， 搅拌20min，趁热过滤，4℃冷却4h。缓慢加入花生浸液，4℃下静置12h，16000r/m离心30min， 上清液继续缓慢加入硫酸铵30g至饱和度达65％，4℃，16000r/m离心30min，沉淀用PBS复 溶，4℃保存；

(4)等电点沉淀

在pH计的监控下等电点沉淀，加2mol/L的H₂SO₄至花生过敏原Arah2pI5.2，25000r/m 离心30min，上清液进一步沉淀，调pH至花生过敏原Arah1pI4.55。所得沉淀物均复溶于PBS 中，即为花生过敏原蛋白提取液；

(5)纯化和制备

将花生蛋白提取液分装入透析袋，用重蒸水透析48h(4℃)蛋白液在透析袋中充分透析 后，使用AKTA系统进行纯化和制备，条件：经Superdex200(10×300mm)凝胶柱层析， 以pH7.0的含0.15mol/L NaCl的50mmol/L磷酸缓冲液进行洗脱，蠕动泵流速25ml/h，10 min间隔自动收集，监测280nm吸收，收集所需峰值样品，合并后用重蒸水4℃下透析24 h，样品冷冻干燥后即为花生过敏原蛋白纯品。

所述花生过敏原标准物的应用，将纯化的花生抗原分别对6只健康雄性新西兰大白兔进 行免疫，把兔子进行编号，分2组，每组3只，免疫前一周从耳缘静脉采血作阴性对照；首 次免疫采用背部皮下多点注射，一个月后进行加强免疫，加强免疫共4次，每次间隔2周； 效价合格后，20％乌拉坦5ml/Kg对兔子静脉麻醉，兔颈动脉放血，将采集的血液于室温下 静置，待血液凝集后放入37℃保温箱静置1h，4℃静置过夜后，4℃、3000r/m离心20min 后，得上清液即为抗血清。