[发明专利]一种诱导捕食线虫真菌同步产生捕食器官的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种诱导捕食线虫真菌同步产生捕食器官的方法，属于应用微生 物学领域。

背景技术：

植物寄生线虫是植物的重要病害之一，全世界每年由于植物寄生线虫所引起 的农作物经济损失达到780亿美元(Barker，1998)。在我国，线虫危害烟草、花 卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、小麦、水稻、林木、中药材等几乎所有的经济作 物，成为农业生产中重要的限制因子之一。目前对线虫病害的防治仍然以化学防 治为主，但由于化学农药对生态环境的影响以及寄生线虫抗药性的增加，使其应 用逐步受到限制，因此采用线虫天敌进行生物防治已日益受到研究人员的关注 (Siddiqui and Mahmood，1996；刘杏忠等，2004)。对线虫真菌天敌的研究已经有 160多年的历史，其中捕食线虫真菌(Nematode-trapping fungi)是自然界中控制 线虫种群数量的一类重要的真菌生物因子。捕食线虫真菌根据形态学特征划分为 节丛孢属(Arthrobotrys)、单顶孢属(Monacrosporium)和隔指孢属(Dactylella) (Subramanian，1963)，它们利用营养菌丝特化形成的捕食器官，如收缩环、非收 缩环、粘性菌丝、粘性分枝、粘性网等完成对植物寄生线虫的捕捉和侵染过程(张 克勤等，2006)。捕食线虫真菌的捕食器官的形态结构十分稳定，不但在捕食线虫 的功能方面有重要意义，而且也是鉴定和分类的重要依据之一。目前，捕食线虫 真菌作为一种有效的生物防治资源已经广泛应用于植物寄生线虫的生物防治(刘 杏忠等，2004)。然而，人们对捕食线虫真菌的侵染机制和分子背景的了解还非常 有限，限制了高效线虫生防制剂的研发和应用。

捕食线虫真菌的捕食器官是其侵染植物寄生线虫的必要条件之一，捕食器官 在营养贫瘠的培养基上可以自发产生，也可以通过环境因子(氨基酸和多肽等) 的诱导产生(Friman et al.，1985)。目前所正式报道的捕食线虫真菌捕食器官的诱 导方法主要包括：饥饿法，在营养贫瘠的培养基上如玉米粉培养基上培养产生； 诱导法，在固体或液体培养基中加入特定的氨基酸或多肽等诱导物质诱导捕食器 官产生；小室法(挖块法)：在固体培养基(平板内)中挖出一块(0.5x 1cm)， 并在其中加入新鲜线虫，诱导捕食器官产生。以上几种捕食器官的诱导方法存在 产生的捕食器官数量有限、捕食器官产生不同步和可控制性不强等缺点。

经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。

发明内容：

本发明的目的是克服现有技术不足，提供一种快速诱导捕食线虫真菌同步产 生捕食器官的方法，迅速获得大量同步的捕食器官，为进一步研究捕食线虫真菌 捕食器官形成的分子机制提供了良好的实验材料。

本发明涉及的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为实验室常规实验用 线虫，能从国内外的线虫保藏机构购买得到。

本发明在常规方法基础上改进而成。本发明实现的步骤如下：

1.培养基和线虫的培养

1)燕麦培养基：用于培养线虫。在250mL三角瓶中加入10g燕麦片(超 市购买)加入30mL去离子水将燕麦片浸润，121℃灭菌20分钟。

2)秀丽隐杆线虫的培养：在灭菌的燕麦培养基中加入1mL的线虫悬液， 21-26℃培养6-7天。培养好的线虫在4℃保存1周。

2.线虫提取物的制备

1)用3层擦镜纸将含有秀丽隐杆线虫的燕麦培养基包好，用贝氏漏斗法过 夜收集燕麦培养基培养的线虫；

2)将收集到的线虫用M9缓冲液(磷酸氢二钠6g；磷酸二氢钾3g；氯化 钠5g；硫酸镁0.25g，水1000mL)清洗，去除残留的培养基；

3)离心收集线虫，4℃，8,000g，离心20分钟；

4)用无菌去离子水悬浮线虫，离心收集线虫，4℃，8,000g，离心20分钟； 重复3次；最后用无菌去离子水悬浮线虫，10g(湿重)线虫加入30mL无菌去 离子水；

5)将线虫悬浮液置于冰水混合物上超声：50％强度，6s ON，3s OFF，10分钟； 放置30分钟后，再次超声，6s ON，3s OFF，5分钟；

6)12,000g，30分钟，离心收集上清；

7)用0.22μm的滤膜过滤上清液，过滤后的上清液即为线虫提取物，分装 后存于-80℃待用。