[发明专利]一种诱导捕食线虫真菌同步产生捕食器官的方法

权利要求书

1.一种诱导捕食线虫真菌同步产生捕食器官的方法，包括线虫培养、线虫 提取物制备，捕食线虫真菌培养和捕食器官诱导步骤，其特征在于本方法具体 如下：

(1).培养基和线虫的培养

a.在250mL三角瓶中加入10g燕麦片，加入30mL去离子水将燕麦片浸 润，121℃灭菌20分钟；

b.秀丽隐杆线虫的培养：在灭菌的燕麦培养基中加入1mL的线虫悬液， 21-26℃培养6-7天，培养好的线虫在4℃保存1周；

(2).线虫提取物的制备

a.用3层擦镜纸将含有秀丽隐杆线虫的燕麦培养基包好，用贝氏漏斗法过 夜收集燕麦培养基培养的线虫；

b.将收集到的线虫用M9缓冲液清洗，去除残留的培养基；

c.离心收集线虫，4℃，8,000g，离心20分钟；

d.用无菌去离子水悬浮线虫，4℃，8,000g，离心20分钟收集线虫；重复 3次；最后用无菌去离子水悬浮线虫，10g线虫加入30mL无菌去离子水；

e.将线虫悬浮液置于冰水混合物上超声：50％强度，6s ON，3s OFF，10分 钟；放置30分钟后，再次超声，6s ON，3s OFF，5分钟；

f.12,000g，离心30分钟收集上清液；

g.用0.22μm的滤膜过滤上清液，过滤后的上清液即为线虫提取物，分装 后存于-80℃待用；

(3).寡孢节丛孢的培养

a.CMA和PDA培养基

CMA培养基：称取20g玉米粉，加入1000mL去离子水，100℃煮沸20分 钟，用6层纱布过滤收集液体，加入20g琼脂，121℃灭菌20分钟；

PDA培养基：去皮马铃薯200g，切块、煮沸30分钟，6层纱布过滤收集 上清液，加入葡萄糖20g，加水补充体积到1000mL，121℃灭菌20分钟；

b.寡孢节丛孢的活化和孢子培养

在CMA固体培养基上接种寡孢节丛孢，26℃恒温培养箱内培养10天，以 得到大量的孢子，用无菌水冲洗CMA平板上的寡孢节丛孢菌丝；用移液器将平 板上的液体转移至装有无菌擦镜纸的漏斗内过滤，收集孢子；用血球计数板计 数并计算孢子的浓度；

c.寡孢节丛孢的液体培养和新鲜菌丝的收集

制备PDA液体培养基，分装于500mL的三角瓶内，200mL培养基/瓶， 在液体培养基内接种孢子，100个孢子/mL液体培养基，摇床培养：26℃，160 rpm，5-6天，用无菌的6层纱布过滤收集菌丝，并用无菌去离子水冲洗菌丝3-4 遍，去除培养基成份，用40mL无菌去离子水悬浮菌丝，用于三维菌网的液体 诱导；

(4).寡孢节丛孢捕食器官的诱导

将收集得到的寡孢节丛孢新鲜菌丝用无菌去离子水悬浮后，在三维菌网诱 导实验组内加入线虫提取物，加入量为1∶10，v/v；在营养菌丝对照组内加入等 体积的无菌去离子水；将平皿静置于26℃恒温培养箱内孵育24-48h，大量的 捕食器官三维菌网产生；诱导结束后，用无菌的4层纱布分别过滤收集对照组 和实验组的菌丝，并用无菌去离子水冲洗菌丝3-4遍；用无菌滤纸去除菌丝内的 水分；菌丝用液氮冻干后，存于-80℃待用。