[发明专利]G-CSF融合蛋白突变体及其制备与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的具有加速粒细胞恢复功能的融合蛋白，制备这种融合蛋白的方法， 含有这种融合蛋白的药物制剂以及在医药领域，尤其是治疗中性粒细胞减少症或白细胞减 少症方面的应用。

背景技术

人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，是一种来源于单核细胞和纤维组织母细胞的长链多肽 糖蛋白，可诱导造血干细胞的增值和分化，促进血液中的中性粒细胞数增加；另外还能刺 激成熟中性粒细胞从骨髓中释放出并激活中性粒细胞的功能。G-CSF的空间主要结构为螺 旋，174个残基中的103个形成了4个α螺旋(Hill CP等，Proc Natl Acad Sci USA， 90：5167-5171，1993)，如图1所示。自1991年起，重组人粒细胞集落刺激因子(rG-CSF) 已经广泛用于治疗癌症化疗导致的骨髓抑制，可以显著改善化疗所引起的中性粒细胞减少 症的严重性和持续时间。目前，已经有多种商业化rG-CSF制剂在销售，如非格司亭 (filgrastim)(商品名为和)，雷诺司亭(lenograstim)(商品名为 和)，那曲司亭(nartograstim)(商品名为)。其中， filgrastim和nartograstim都是重组大肠杆菌细胞产生的非糖基化的rG-CSF，而 lenograstim是CHO细胞表达的带糖基化的rG-CSF。

但是，天然或重组的G-CSF由于分子量较小，极易被肾小球过滤，在人体内的循环半衰 期很短，只有2-4小时，每个化疗周期需要每天注射1-2次，持续注射5-7天(Welte K等， Proc Nat Acad Sci USA，82：1526-1530，1985；Frampton JE等，Drugs，48：731-760， 1994)。延长G-CSF制剂体内半衰期可以减少给药次数。增加G-CSF蛋白质的体内半衰期的 一个途径是减少蛋白质的体内清除，包括通过肾脏的清除、蛋白酶降解和受体介导的清除。 可以通过将G-CSF蛋白与能增加表观分子量的某些组分耦联，从而降低肾脏的清除速率。 同时，将蛋白与这些组分连接可以有效地阻止蛋白酶与蛋白的接触，从而降低被蛋白酶的 降解速率。血清中存在的一些长半衰期的蛋白，如白蛋白和IgG，存在一种FcRn介导的内 吞保护作用。其基本原理是：IgG的Fc部分和白蛋白在正常生理状态下可以与细胞表面相 应的FcRn受体结合，结合后被内吞，在吞噬小泡中因为pH下降，其结合复合物解离，IgG 和白蛋白重新从细胞中被释放，正是因为存在FcRn介导的循环作用保护了IgG和白蛋白不 被降解和代谢(Junghans RP，Immunol Res.，16：29-57，1997；Chaudhury C等，J Exp Med.，197：315-322，2003；Chaudhury C等，Biochemistry.，45：4983-4990，2006)。 因此G-CSF与HSA或者IgG的Fc片段融合具有更长半衰期。通过聚乙二醇修饰重组人粒细 胞集落刺激因子(PEG-rG-CSF，商品名)(Harris JM，Clin Pharmacokinet， 40：539-551，2001)，可使G-CSF半衰期获得了延长。通过白蛋白融合技术，即通过基因 工程方法将人白蛋白与G-CSF融合表达获得的rHSA/G-CSF，也能提高G-CSF在体内的半衰期 (Wendy Halpern等，Pharm Res，19：1720-1729，2002)；同样的，通过与抗体Fc片段融 合，也可以显著改善G-CSF在体内的半衰期(Cox George N等：Experimental Hematology， 32：441-449，2004)。

但是，现有的长半衰期G-CSF在临床应用还是存在很多缺陷。

首先，虽然用PEG修饰或者白蛋白融合等技术可以提高G-CSF的分子量而改善其半衰期， 但是，由于G-CSF受体介导(receptor mediated clear，RMC)的清除路径的存在，如下 文更加详细的描述，这种改善也是有限的。