[发明专利]一种分离脐带间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种快速充分获得脐带间充质干细胞的方法。

背景技术

随着组织工程组织、器官的研究不断深入，人工可吸收材料的研究已经渐趋成熟，但是制约组织工程发展的主要瓶颈——种子细胞短缺，越来越突出。以前构建组织工程产品主要是利用成体细胞，但是成体细胞是终末分化细胞，要么分裂增殖能力有限，要么根本就无法扩增(如神经元)，很难在短时间内获得足够量的种子细胞构建组织或器官。另外，成体细胞取材也非常局限，异体来源存在免疫排异，而自体取材，会带来新的创伤，更有些根本就无法进行自体取材，所以寻找一种新的细胞治疗或组织工程种子细胞的来源非常的迫切、必要。因为干细胞细胞具有多强大的自我增殖，扩增能力，且可以多项分化为不同的组织细胞，所以成为细胞治疗和组织工程种子细胞的新的来源。

干细胞主要有胚胎干细胞和成体干细胞；胚胎干细胞具有非常强大的自我增殖、扩增能力，低免疫原性且已经证明几乎可以分化为所有组织细胞。但是胚胎干细胞研究受伦理、法律等的限制，且自身也存在干细胞分化残留，形成畸胎瘤的危险，所以目前研究及应用都有很大的局限性。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是成体干细胞的一种类型，具备干细胞的重要特征：强大的自我增殖能力、多项分化潜能及低免疫原性。MSCs起源于中胚层，已有大量中外文献报道可以诱导分化为骨、软骨、脂肪等中胚层来源的组织。近期又有文献报道，在适宜的体内体外环境下MSCs不仅可以分化为中胚层的间质组织，还可以诱导分化为肝细胞、神经细胞等内胚层、外胚层来源的组织细胞。将MSCs与胎鼠的中脑或纹状体细胞共同培养，它可以分化为神经元和胶质细胞，而将MSCs移植到心肌缺血坏死区周围，3周后逐渐与周围心肌细胞形态相似，并可见到大量新生血管在原来坏死区域。目前大多数学者认为MSCs的分化由特殊的转录因子决定，不同的诱导条件可以诱导其向不同的方向分化，这些诱导条件启动了决定分化方向基因得转录、表达或表达量的上调。

成体干细胞主要指MSCs。最早MSCs的研究主要来源于骨髓，且目前已有大量中外文献报道，骨髓间充质干细胞可以诱导分化为脂肪、骨、软骨、神经元及神经胶质等各种组织细胞。但是骨髓干间充质干细胞(BMSCs)采集过程对供者造成痛苦，分离细胞量有限，且随着年龄增长其干细胞数量和增殖能力也显著下降，较难满足临床需要。最近研究表明脐血和脐带内含有大量的MSCs，但是脐血MSC含量稀少，分离困难，不适合规模化操作，其采集也面临着伦理学的限制。

传统获得人脐带间充质干细胞是采用胶原酶消化胎儿脐带华通胶过夜法。但是，该方法消化后获得的混悬液粘稠，难于离心获得大量脐带间充质干细胞，且消化时间长，细胞活性差，难于获得可供扩增用的MSCs。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速充分获得脐带间充质干细胞的方法。

本发明采用复合胶原酶和透明质酸酶序列消化的新方法在短时间内获得大量脐带间充质干细胞。

具体而言，本发明的一种分离脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)将在无菌情况下获得的脐带去除动、静脉，制成组织碎块，再加入含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液清洗，离心弃上清；

(2)将步骤(1)中获得的脐带碎块，加入2-4倍于碎块量体积的质量/体积比为0.1-0.2％胶原酶NB4消化，消化温度为37℃，在摇床中振荡消化2-3小时；得混合物1；

(3)将步骤(2)得到的混合物1中，加入其体积1/4-1/2量的质量体积比为0.1-0.2％的透明质酸酶，37℃消化10-30分钟；得混合物2。

(4)将步骤(3)得到的混合物2中，加入等体积的质量体积比为0.01-0.02％乙二胺四乙酸磷酸盐溶液，37℃摇床振荡10-20分钟；得混合物3。

(5)将步骤(4)得到的混合物3，用100-200目滤网过滤，收集滤过液。

(6)将步骤(5)收集的滤过液以600g离心5-10分钟，弃去上清液，用DMEM培养基清洗2-3次，即获得脐带间充质干细胞。

上述方法中，青霉素和链霉素主要是保持在无菌环境下操作。

上述方法中，步骤(1)中磷酸盐缓冲液通常含有60-120u/ml的青霉素或者60-120u/ml的链霉素。

上述方法中，去除脐带动、静脉需要在显微镜视野中进行，以便完全去处血管组织。