[发明专利]一种检测双烯雌酚的金标免疫层析半定量检测试纸

说明书

技术领域：

本发明免疫检测和兽药残留检测技术领域。本发明涉及一种雌激素双烯雌酚残留的快速检测工具，具体而言，本发明涉及一种双烯雌酚金标免疫层析半定量检测试纸及其制备方法和使用方法。

背景技术：

双烯雌酚(dienestrol，DE)是一种人工合成的非甾体类雌激素，其化学名为3，4-双(对羟基苯基)-2，4-己二烯，含有酚羟基，是一种弱酸性化合物，主要应用于提高奶牛产奶量和畜禽动物的生长催肥。相对于天然雌激素，人工合成雌激素通常比较稳定，在体内滞留时间长，易在人和动物的脂肪及其他组织中残留，因此，可以通过食物链危害人类健康。具体表现为女性幼儿提前发育，男性儿童乳腺发育成女性化；男性生殖发育异常与病变及女性乳腺癌和子宫内膜异位症发生率上升，同时具有致癌作用。目前，世界上许多国家禁止其应用。

现有的双烯雌酚检测方法为色谱法，但是这些方法需要有完善的实验室，有经验的技术人员及昂贵的仪器设备，且检测过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术为小分子残留物的分析检测提供了一个新的途径。基于此原理建立的酶联免疫吸附测定技术具有便捷，快速，灵敏等特点，但是该技术要求检测人员具有较高的技术水准，也需要酶标仪等简单的设备，分析时间一般1-4小时，仍然有其局限性。因此，需要我们研制更加简单快捷方便的检测工具。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种简便、快捷、灵敏、价格低廉的双烯雌酚免疫层析半定量检测试纸及其使用方法。

本发明提供的双烯雌酚金标免疫层析半定量检测试纸是在涂有不干胶不吸水的聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)背衬上依次贴有样品吸收垫、胶体金标记垫、检测反应垫和吸水垫。

所述的胶体金标记垫为玻璃纤维或醋酸纤维或尼龙膜，其上标记的物质为双烯雌酚多克隆抗体。

所述的检测反应垫上面包被有双烯雌酚人工抗原作为检测线，同时还包被有第二抗体作为质控线。本发明中双烯雌酚人工抗原为双烯雌酚与载体蛋白的偶联物，载体蛋白一般用牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)。

第二抗体是与双烯雌酚抗体不同种动物的抗双烯雌酚抗体的抗体。

本发明所述的双烯雌酚免疫层析半定量检测试纸的各部分制备方法与及功能如下：

1、背衬：为一面涂有不干胶的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的功能。

2、样品吸收垫的制备：将滤纸或玻璃纤维纸浸入pH7.4的PBS溶液中2分钟，取出80℃烘干或其他方式干燥，作为样品吸收垫，便于样品溶液向上移动。

3、胶体金标记物垫的制备：该部分起承载胶体金标记抗体的作用。包括金溶胶的制备，双烯雌酚抗体的金标记，胶体金标记物的处理。

(1)胶体金溶胶的制备：将HAuCl₄先配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸。搅动下准确加入1.2ml的1％柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)水溶液。继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。全过程约2～3min。冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。电子显微镜观察金溶胶颗粒的均匀度，经测定所制备的胶体金溶胶颗粒直径为40nm。

(2)胶体金标记双烯雌酚抗体：取两支试管，向其中各加入1.2ml步骤(1)中制备的40nm胶体金溶胶，加入适量25mM K₂CO₃把pH调整为90，分别加入10μl浓度为1mg/ml双烯雌酚抗体，混匀，室温放置10min，分别加入12μl 2％PEG20000，室温放置5min，10000rpm离心20min，轻轻吸除上清，用20μl PBS溶液重悬浮松散的胶体金沉淀，并集中到新管中，分别加20μl甘油，充分混匀，即为胶体金标记双烯雌酚抗体，-20℃保存备用。

(3)胶体金标记垫的制备：用Biodot点膜机将胶体金标记双烯雌酚抗体喷点在胶体金结合垫上，将双烯雌酚-BSA偶联物和羊抗兔IgG包被在硝酸纤维素膜的检测区和质控区，充分干燥。

4.吸水垫的制备：将玻璃纤维纸或滤纸或吸水纸室温干燥后，即为吸水垫。吸水垫的主要作用是吸收移动上来的多余样品溶液。