[发明专利]细粒棘球蚴基因工程疫苗候选分子P-29

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及人畜共患寄生虫病基因工程疫苗，特别针对肝包虫病的基因工程疫苗。 

背景技术

细粒棘球蚴虫病，俗称包虫病，是由细粒棘球蚴感染人和食草类家畜所引起的寄生虫疾病。由于细粒棘球蚴主要寄生于人的肝脏，故该病又称为肝包虫病。它呈世界性分布，严重危害人类的健康和农牧业经济的发展，是全球性的公共卫生问题。据近年普查，我国有25个省、市和自治区有该病的病例报道，其中以新疆、宁夏、甘肃、青海、西藏、四川、内蒙古7个省(区)流行最为严重，高发区约占全国面积的44％，受威胁人口约5千万。该病已被列为我国重点防治的寄生虫病之一。 

目前，对人包虫病的首选治疗方法是外科手术，但由于该病发病早期可无自觉症状，等到入院就诊时，相应的脏器已经受到严重的损伤并且手术本身对机体也有损伤，从而使患者在健康和经济上都蒙受了极大的损害。对于较早期小棘球蚴或有手术禁忌的病例可采用阿苯哒唑或甲苯咪唑等药物进行化疗，临床发现这些药物存在严重的毒副作用，部分患者不能耐受，同时某些化疗患者可产生耐药性。 

近年来，随着分子生物学技术的迅速发展及在医学科学中的广泛应用，利用基因工程技术对病原体进行分子疫苗的预防研究引起了人们的广泛观注。从目前的研究情况来看，国内外对细胞粒棘球蚴虫研究较为成功的重组疫苗有Eg95，它已在人工感染的牛和羊群获得了较好的免疫保护水平，免疫保护力达到96-98％。我们研究的细粒棘球蚴重组疫苗EgP-29的免疫保护力也达到了96.6％。因此，该疫苗候选分子将有望在肝包虫预防中发挥着巨大的作用。 

发明内容

本发明的目的是提供一种细粒棘球蚴重组疫苗候选分子，其具备安全、经济、有效、制备简单、性能稳定、使用方便、可产生较持久免疫保护效果等优点。从而有效控制人畜感染，减少人畜患病人数，使国家、人民减少财产损失，并带来巨大的经济效益。 

本发明通过利用生物信息学技术登陆NCBI/GenBank公共数据库，检索出已发表细粒棘球蚴(乌拉圭株)诊断抗原P-29基因序列(GenBank序列号：AF07893)，参照检索的基因序列设计并合成引物，以中国宁夏地区病人手术后获得的细粒棘球蚴原头蚴中提取的总RNA为模板，通过RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴的P-29基因；通过对扩增出的P-29基因DNA序列分析，证实该扩增基因与乌拉圭株P-29基因序列完全一致，表明我们成功克隆出的细粒棘球蚴(中国大陆株)P-29基因；通过DNA重组技术，将克隆出的P-29基因与表达载体pET-28a构建成重组质粒，并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)plysS中，成功的构建出含细粒棘球蚴(中国大陆株)P-29基因的基因工程菌株；通过对工程菌株的诱导表达及通过含Ni²的His-bind树脂亲合柱纯化出重组蛋白rEgP-29。经免疫学鉴定 初步说明rEgP-29有较好的抗原性及免疫原性，具有抗包虫病疫苗候选分子的潜能。通过上述步骤获得的重组蛋白EgP-29背部多点注射免疫小鼠，每两周免疫1次，共3次。从宁夏医科大学附属医院肝胆外科住院包虫病患者手术摘除的完整包囊中，无菌条件分离原头蚴，用原头蚴攻击免疫小鼠(1.5×10⁴个原头蚴/ml悬液)，攻击感染20周后剖杀小鼠，切开小鼠腹部，计数肝脏及肠系膜处的棘球蚴包囊，根据Dempster计算免疫保护力，公式：免疫保护力(％)＝(1-免疫组平均包囊数/对照组平均包囊数)×100％。经计算用重组蛋白EgP-29免疫小鼠后，免疫保护力达到96.6％。 

附图说明

(图1)细粒棘球蚴重组疫苗候选分子制备流程图、(图2)重组表达质粒酶切鉴定(M1.200bp DNA marker；M2.Lander DNA HindIII marker；1.未酶切重组表达质粒；2.酶切重组表达质粒；3.RT-PCR产物；4.酶切空表达质粒；5.未酶切空表达质粒)、(图3)重组蛋白细粒棘球蚴中国大陆株P-29(EgP-29)表达及纯化电泳图谱(M.蛋白分子量Marker；1.重组蛋白纯化产物；2.EgP29/pET28a/BL21plysS诱导产物；3.BL21plysS诱导产物)。 

具体实施方式

细粒棘球蚴组疫苗候选分子的制备 

1.利用生物信息学技术检索目的基因片段