[发明专利]抗CD20抗体片段与力达霉素的融合蛋白、制备方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤学和生物药学领域。具体而言，本发明提供了可以产生靶向肿瘤杀伤作用的融合蛋白、其制备方法及其用途，进而为肿瘤的靶向治疗提供了优良的候选药物。

技术背景

非霍奇金淋巴瘤(NHL)是一种起源于淋巴组织的恶性肿瘤，其发病率和死亡率已居恶性肿瘤第5位。常规的放疗和化疗虽然对NHL有效率较高，但选择性差，在杀伤肿瘤细胞的同时也可能损害体内某些类型的正常细胞，常出现较明显的毒副反应，因此肿瘤靶向治疗已成为提高治疗效果的一条重要途径。

在肿瘤靶向治疗中，靶向治疗的靶点选择非常重要，已知大多数NHL起源于B淋巴细胞，95％以上的B细胞NHL表达CD20抗原，而CD20又仅在前B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞、激活B淋巴细胞中表达；在浆细胞、淋巴多能干细胞以及其它组织均无表达，且CD20抗原比较暴露，人体血清中也无游离的CD20存在，因此CD20可作为治疗B细胞淋巴瘤的有效靶点。

在靶向治疗中使用最多的是与肿瘤相关抗原相关的单克隆抗体。自从1997年美国FDA批准抗CD20人鼠嵌合抗体利妥昔抗体(Rituximab)上市，人们对抗体药物产生了极大的期望，另外，最近利用抗CD20抗体治疗自身免疫性疾病如：类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮等成为新的研究热点，这也提示抗CD20抗体的治疗应用范围将进一步得到扩展。但随着使用单抗进行治疗的病例数的增加，药物抗性的问题也越来越明显。随之发展起来的¹³¹I标记的抗CD20鼠源性抗体Bexxar和⁹⁰Y标记的Zevalin抗体，作用机制与利妥昔抗体不同，克服了药物抗性，但免疫原性大，只能一次注射，且毒副反应大，患者耐受性差。因此研制以CD20为靶点的小型、高效的抗体靶向药物成为当务之急。

发明简述

针对这种现状，申请人设想采用小型化抗CD20抗体片段(靶向载体)与强效抗肿瘤药物(弹头)相结合的策略。

在进行小型化抗体片段选择时，申请人选择了抗CD20抗体Fab片段和抗CD20抗体的scFv片段作为靶向载体。其中Fab片段是由重链可变区VH、恒定区中的CH1和轻链可变区VL、恒定区CL组成，单链抗体(scFv)是由抗体分子中的重链可变区VH和轻链可变区VL通过连接肽(通常为[GlySer4]₃)连接而成，它们均具有分子量小、穿透力强、体内半衰期短以及易于基因改造和可通过细菌发酵大量生产等优点。而且由于Fab、scFv分子量小，免疫原性小而不易产生HAMA反应，且易穿透致密的肿瘤细胞间隙屏障，可进入实体瘤深部；同时它们均缺乏Fc片段，避免了Fc介导的受体结合作用，使得其快速向靶部位集中；此外还易于在体外进行基因改造，通过基因重组技术，在编码Fab、scFv基因后面连接上活性蛋白基因，并在受体中表达，产生靶向融合蛋白。因此抗体Fab片段及scFv作为肿瘤靶向药物的载体具有诱人的前景。

在进行“弹头”选择时，申请人选择了高活性的“弹头”药物力达霉素(LDM)，亦称C-1027或C1027，是从中国湖北省潜江县土壤中分离得到的一株由球孢链霉菌(Streptomyces globisporus，菌种保藏编号：CGMCC No.0704)产生的烯二炔类抗生素，是迄今报道过的对肿瘤细胞杀伤作用最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素。LDM由两部分分子组成：一为烯二炔结构的发色团(active enediyne，AE)，具有细胞毒作用，但不稳定；另一为110个氨基酸残基组成的辅基蛋白(LDP)，对发色团的稳定起保护作用。发色团和辅基蛋白通过非共价键结合，两者结合具有特异性和牢固性，LDM的辅基蛋白和发色团可以拆分和进行分子重建。LDM以其独特的分子结构适合作为“弹头”药物。