[发明专利]转基因水果的多重PCR反应的检测方法

权利要求书

1.一种转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)设计并选取至少包括下列两对引物序列；

35SFZMP1： SEQ ID No：1；

35SFZMP2： SEQ ID No：2；

nos FZMP1：SEQ ID No：3；

nos FZMP2：SEQ ID No：4；

(2)以十六烷基三乙基溴化铵法提取待测水果基因组DNA并测定DNA浓度；以所提取的DNA为模板在包括步骤(1)的引物序列的PCR反应体系中对35S启动子、NOS终止子、植物内源rbcl基因进行多重PCR扩增；

(3)限制性内切酶对多重PCR扩增结果进行酶切反应，经琼脂糖凝胶电泳分析及DNA测序证明水果是否含有转基因成分。

2.根据权利要求1所述的转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于所述的引物序列对为三对引物序列：

35SFZMP1： SEQ ID No：1；

35SFZMP2： SEQ ID No：2；

nos FZMP1： SEQ ID No：3；

nos FZMP2：SEQ ID No：4；

rbcL-F：   SEQ ID No：5；

rbcL-R：   SEQ ID No：6。

3.根据权利要求1所述的转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于所述待测水果选自木瓜、梨、哈密瓜、香蕉。

4.根据权利要求1所述的转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于所述步骤(2)中测定DNA浓度包括对提取的DNA稀释定倍量后，以ddH₂O为对照，通过紫外可见分光光度计测定A260、A280值来计算。

5.根据权利要求1所述的多重转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于步骤(2)中PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液     终浓度10×；

dNTPs         0.2～0.4mM； 

引物序列      终浓度为0.2mM；

模板DNA       1～10ng/μL；

TaqDNA聚合酶  0.04～0.08U/μL；

MgCl₂终       浓度为6mM；

溶剂为ddH₂O；

PCR反应条件为：92～97℃预变性4～9min；92～97℃变性20～40s，56～60℃退火40～70s，70～75℃延伸20～40s，30～40个循环；70～75℃延伸8～12min。

6.根据权利要求1所述的转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于所述步骤(3)中酶切反应的酶切位点为：

XmnI酶切位点：5’...GAANN↓NNTTC...3’

              3’...CTTNN↑NNAAG...5’；

Mph酶切位点：5’...ATGCA↓T...3’

             3’...T↑ACGTA...5’；

Van91I酶切位点：5’...CCANNNN↓NTGG...3’

                3’...GGTN↑NNNNACC...5’；

EcoR V酶切位点：5’...GAT↓ATC...3’

                3’...CTA↑TAG...5’；

Xba I酶切位点：5’...T↓CTAGA...3’

               3’...AGATC↑T...5’。

7.根据权利要求1所述的转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于所述步骤(3)中酶切反应的限制性内切酶选自：PdmI限制性内切酶、EcoRV限制性内切酶、Mph限制性内切酶、Van91I限制性内切酶、Xba I限制性内切酶。

8.根据权利要求1所述的转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于所述步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳分析是经2％琼脂糖凝胶电泳后根据电泳 结果是否出现特异性条带，判断待测水果是否含有相应外源基因。