[发明专利]抑制人膜铁转运蛋白辅助蛋白基因表达的siRNA重组慢病毒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学、生物医药及基因工程技术领域，具体涉及利用慢病毒(Retrovirus)介导的RNA干扰技术，构建针对人膜铁转运蛋白辅助蛋白基因(HEPH)的慢病毒干扰体系(Retro-Heph)，及在制备铁代谢紊乱疾病的药物中的应用。

背景技术

RNAi指的是当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象。

2001年，Tuschl等将短的siRNA导入到哺乳动物细胞中并由此解决了在哺乳细胞内导入长的双链RNA时引发的干扰素效应，由此拓展了RNAi在基因治疗上应用前景。RNAi机制普遍存在于生物中，因此被认为是进化上相对保守的基因表达调控机制。一种假说为，RNAi机制是作为在RNA水平上抵御病毒入侵的防御机制而存在的。目前发现，RNAi机制中的相关一些因子如内源性双链RNA及蛋白因子可以在多种层次上对基因表达进行调控，其范围已经超越了PTGS(post transcriptional gene silencing)，如RNAi机制同样参与了转录水平上的基因表达调控过程中。由外界导入的长的双链RNA首先被称作Dicer并具有RNaseIII活性的RNA酶切割成21～23碱基对的小的双链RNA，这种RNA被称作small interferingRNA(siRNA)，其特征是3′端相对于互补链突出两个碱基。完成上述过程后，siRNA上结合RNAi蛋白因子，并形成称为RISC(RNA-induced silencingcomplex)的RNA-蛋白复合物。在RISC复合物中，siRNA依赖于ATP/或ATP非依赖性的转换为单链，进而RISC被活化。活化型RISC受已成单链的siRNA引导(guide strand)，序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶mRNA的特异性分解。

RNAi在基因沉默方面的具有高效性和简单性，所以是基因功能研究的重要工具。大多数药物属于靶标基因(或疾病基因)的抑制剂，因此RNAi模拟了药物的作用，这功能丢失(LOF)的研究方法比传统的功能获得(GOF)方法更具优势。因此，RNAi在今天的制药产业中是药物靶标确认的一个重要工具。同时，那些在靶标实验中证明有效的siRNA/shRNA本身还可以被进一步开发成为RNAi药物。在疾病治疗方面，双链小分子RNA或siRNA已被用于临床测试用于几种疾病治疗，如老年视黄斑退化。

然而RNA干扰片段表达持续以及表达效率等重要问题阻碍了RNA干扰技术运用于临床治疗，要将RNA干扰用于基因治疗，必须解决其靶向性、安全性以及表达持续性的问题。

shRNA即短发夹RNA(short hairpin RNA)。在RNAi感染过程中，产生dsRNA的一个有效方法就是在体内表达一个短发夹RNA，这种shRNA包含两个短反向重复序列(其中一个与目的基因互补)，中间由一个loop序列分隔，组成发夹结构。在体内shRNA可以被加工成siRNA，从而降解目的基因抑制其表达。

膜铁转运蛋白辅助蛋白基因(HEPH)介绍

早在1962年，Grewal等就在放射诱导的突变小鼠中发现了一种新型的遗传性小细胞低色素性贫血。由于其与X染色体相关，这种小鼠被称为sla(伴性贫血)小鼠。Vulpe等(1999)通过基因谱研究，证实了sla小鼠X染色体上缺陷基因的存在。此基因被命名为Hephaestin(HP或Heph)，取自希腊神话中的金属工艺之神Hephaestus。

Heph的分布

HP在体内的分布与铁的吸收相关。免疫杂交技术和Westen印迹法、Northern印迹法显示在成年小鼠体内HP蛋白及mRNA在整段小肠及结肠内高表达，在肾、肺、皮肤、肝、胎盘及其他组织中也有表达。原位杂交技术显示在HP基因高表达的小肠区，绒毛处信号极强，而隐窝处几乎没有阳性信号。这与铁在小肠绒毛处的吸收相一致。但HP在结肠高表达，而后者在铁吸收过程中的作用甚微。在肠上皮细胞中，HP蛋白定位于基侧膜，同时存在于细胞内的核周区；在培养的大鼠小肠细胞系IEC26中，HP蛋白主要分布于核周区，在细胞浆中也有少量存在。

Heph的功能