[发明专利]对转基因成分进行检测的聚合酶链式反应芯片法

说明书

技术领域

本发明涉及水稻、玉米、大豆、油菜籽、马铃薯、番茄、西葫芦、甜瓜及其加工产 品中以及植物性饲料中转基因成分进行检测的聚合酶链式反应芯片法。

背景技术

由于对转基因食品安全性的不确定性，使得各国对转基因产品的管理从未放松过， 而且越来越严格和规范。但随着越来越多转基因动植物的诞生，转基因产品的复杂性对 管理部门的检测技术提出了挑战。

目前对转基因产品的检测多采用PCR法，该方法有较高的灵敏度和准确性，但面 对越来越多需要检测的外源基因，该方法的效率已成为瓶颈。而以高通量著称的基因芯 片(gene chip)法，能满足同时检测大量基因的需要，但将该方法应用到转基因检测时， 由于植物产品含有较多的次生代谢物质，所提取的DNA不能直接用于芯片检测，而要 先经过PCR扩增，扩增产物才能用于芯片检测。因此普通基因芯片法并不能解决检测 效率低的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种结合PCR技 术和芯片技术形成的聚合酶链式反应芯片法(简称PCR-chip法)，使PCR扩增和芯片检测 同步化，提高检测效率，且能同步完成水稻、玉米、大豆、油菜籽、马铃薯、番茄、西 葫芦、甜瓜及其加工产品中以及植物性饲料中物种成分鉴定，外源基因鉴定，及转基因 植物品系鉴定。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

1、芯片引物的设计及芯片制作

选用四类引物(见表1)：第一类为植物通用内源基因，用于鉴定从植物源产品中 抽提获得的DNA的质量是否符合实验要求；第二类为物种鉴定基因，用于成分鉴定，包 括对水稻、玉米、大豆、油菜籽、马铃薯等的鉴定，也可用于鉴定DNA的质量是否符合 实验要求；第三类为外源基团，用于外源基因鉴定，包括一系列启动子、终止子、各种 目的基因等；第四类为转基因植物品系鉴定基因，用于转基因植物的品系鉴定，包括中 国允许进口和不允许进口的上述植物的各种转基因品系。将上述四类引物中的下游引物 的5’修饰10个连续的(GA)序列(5’-(GA)₁₀-引物序列-3’)，并将此端固定在芯 片上，点样量设定为50pmol/点，每个引物在芯片上重复3次，完成芯片的制作。

在设计芯片时，对引物的筛选考虑了对DNA质量的判断，即通过植物通用的内源 基因，判断用于实验的DNA的质量是否可靠，以防由于DNA的质量而导致的假阴性； 同时对一些已知其物种特异性基因的植物，包括水稻、玉米、大豆、油菜籽、马铃薯， 设计相应引物，进行物种(成分)的鉴定；并针对一系列启动子、终止子、抗除草剂基 因、抗虫基因、抗病毒基因和品质改良基因等外源基因设计引物，鉴定是否为转基因产 品和转入的是什么外源基因等；最后通过在外源基因和植物内源基因组之间的边界序 列，或两个特异性外源基因之间的搭界序列设计引物，对该转基因产品品系进行鉴定。

因此该芯片，不但能鉴定是否为转基因产品，同时能对物种(成分)和品系进行鉴 定。

表1引物序列

2、芯片上的PCR反应

1)芯片预处理。将制备好的芯片浸泡在小牛血清(BSA，10mg/ml)中，室温，0.5-1 小时；磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.4)冲洗数变；灭菌水冲洗数变；干燥；在芯片引物阵列 外围粘上原位框(25μl)，形成PCR加样区，备用。

2)PCR加样和PCR程序：在芯片的25μl体系中，加入PCR缓冲液，MgCl₂，dNTP， taq酶，及需要检测基因的上游引物(该引物的5’端用Cy5染料标记，引物的量控制 在50pmol左右)，需检测样品的高质量的DNA，加水补足25μl。加样完毕后，加盖密 封PCR反应区。PCR反应程序为：95℃，1min；40个循环(95℃，30S；55-60℃，150S； 72℃，60S)；72℃，10min。

3、芯片检测

PCR程序完成后，用含0.1％吐温20的5×SSC缓冲液清洗芯片数次，在芯片扫描仪 上检测Cy5荧光强度，读取和分析数据。