[发明专利]用于检测小RNA的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及小RNA的检测领域。

背景技术

小RNA是非编码RNA家族(noncoding RNA，简称ncRNA)中的重要组成部分，包括微小RNA(microRNA或miRNA)、小型干扰RNA(siRNA)、小核RNA、小时序RNA，piwi蛋白结合RNA(piRNA)等。研究发现小RNA在生物体内细胞、组织等的发育、生长、分化，甚至疾病的发生以及病毒的入侵和防御等方面发挥至关重要的作用。小RNA发挥作用的方式也是多种多样，它们既可以通过修饰DNA直接调控基因的表达，也可以通过改变基因转录产物的稳定性等来调节蛋白的量等等。而在各种类型的小RNA中，微小RNA又是功能最为重要的一种。

微小RNA是生物体内源的长度为18-25个核苷酸的一种非编码RNA分子。它们广泛地分布在不同的器官中，主要是通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制。在过去十年中，科学家们从海藻到动物体内分离鉴定出了数千种保守的和非保守的miRNA。虽然很多证据清楚地表明miRNA在细胞增殖、分化、凋亡、发育、肿瘤发生、肿瘤转移以及病毒感染等等一系列生物学过程中充当很重要的角色，但是我们对miRNA生理学功能的了解还很少。另外，大量的研究发现miRNA是通过对它们的目标mRNA进行微调来实现其生理功能的，因而，对miRNA进行准确、定量的分析就成了理解miRNA生理学功能的迫切需要。

然而，由于miRNA很短，而且一些miRNA成员之间具有非常相似的序列(例如let-7家族系列)，检测miRNA是一项非常有挑战性的工作。科学家们在这个领域进行了大量的研究工作，并开发出了一系列的miRNA检测方法，如Northern印迹法(Lee，R.C.，Feinbaum，R.L.and Ambros，V.1993.The C.elegans Heterochronic Gene lin-4 Encodes Small RNAs withAntisense Complementarity to lin-14.Cell 75：843-854.；Pfeffer，S.，Sewer，A.，Lagos-Quintana，M.，Sheridan，R.，Sander，C.，Grasser，F.A，van Dyk，L.，Ho，C.，Shuman，S.，Chien，M.，et al.2005.Identification of microRNAs of the herpesvirus family.Nature Methods 2：269-276.)、侵染检测(Allawi，H.T.，Dahlberg，J.E.，Olson，S.，Lund，E.，Olson，M.and Ma，W.P.2004.Quantitation ofmicroRNAs using a modified Invader assay.RNA 10：1153-1161.)、夹板连接(SplintedLigation)(Maroney，P.A.，Chamnongpol，S.，Souret，F.and Nilsen，T.W.2007.A rapid，quantitative assay for direct detection of microRNAs and other small RNAs using splinted ligation.RNA 13：930-936.)、基于LNA探针的检测方法(Weinholds，E.，Kloosterman，W.P.，Miska，E.，Alvarez-Saavedra，E.，Berezikov，E.，Bruijn，E.de，Horvitz，H.R.，Kauppinen，S.and Plasterk，R.H.A.2005.MicroRNA Expression in Zebrafish Embryonic Development.Science 309：310-311.；Kloosterman，W.P.，Weinholds，E.，Bruijn，E.de，Kauppinen，S.and Plasterk，R.H.A.2006.In situ detection of microRNAs in animal embryos using LNA modified oligonucleotide probes.Nat.Methods 3：27-29.)与上述几种方法相比，一些实时RT-PCR方法由于具有很高的灵敏度和特异性，正逐渐成为miRNA定量分析的主要方法(Chen，C.，Ridzon，D.A.，Broomer，A.J.，Zhou，Z.，Lee，D.H.，Nguyen，J.T.，Barbisin，M.，Xu，N.L.，Mahuvakar，V.R.，Andersen，M.R.，et al.2005.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.Nucleic Acids Res.33：e179.；Shi，R.and Chiang，V.L.2005.Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR.Bio techniques 39：519-525.；Raymond，C.K.，Roberts，B.S.，Garrett-Engele，P.，Lim，L.P.andJohnson，J.M.2005.Simple，quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring ofmicroRNAs and short-interfering RNAs.RNA 11：1737-1744；Li，J.，Yao，B.，Huang，H.，Wang，Z.，Sun，C.，Fan，Y.，Chang，Q.，Li，S.，Wang，X.，Xi，J..Real-time PCR microRNA detection based onenzymatic stem-loop probes ligation.Anal Chem.DOI：ac900598d(in press))。