[发明专利]用于Hum j 3检测的夹心ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种以小鼠杂交瘤单抗和天然葎草花粉纯化主要致敏蛋白Hum j3为基础的检测Hum j3含量的夹心ELISA试剂盒，其在临床实践、变应原制药工业生产、质控与新药研发、气候与环境中Hum j3含量监测与预报中有重要的实际运用价值。

背景技术

蔷薇亚纲大麻科一年生缠绕草本植物葎草(Humμlus japonicus或Humμlus scandens)，原产我国，广泛分布于远东地区，我国除新疆、青海以外的各省区均有分布，东亚各国(朝鲜、日本、俄罗斯、越南)以及欧洲、美国西海岸地区亦有分布。上世纪八十年代由北京协和医院牵头的第一次全国性气传致敏花粉调查中，在79个花粉收集点中有53个点可收集到葎草花粉，仅次于蒿属花粉，其分布范围基本上覆盖全国，播散高峰为八、九月。北京协和医院首次发现葎草花粉是我国夏秋季节仅次于蒿属花粉的重要致敏原，是导致临床上出现变应性鼻炎、过敏性结膜炎、花粉性皮炎、季节性哮喘等花粉症症状的重要病因，很大程度上影响了患者的生活质量。

现阶段对于花粉症的诊断和治疗，依赖于特异性变应原疫苗(Specific Allergenic Vaccines)。变应原疫苗是指包括变应原提取物以及其它成分的生物制剂，可有效用于人类过敏性疾病的诊断、预防和治疗。变应原特异的免疫治疗(Allergen-Specific Immunotherapy，SIT)通过调节抗原提呈细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞的免疫应答以及调节介导变态反应效应细胞的功能和数量，从而减轻患者症状。WHO发布指导文件指出，SIT是唯一能影响过敏性疾病自然病程、有效阻止变应性鼻炎进展为哮喘的治疗方法。

尽管SIT是目前成熟的针对花粉症病因治疗的方法，由于现阶段用于变应性疾病免疫治疗的变应原浸液大部分直接从天然生物组织中提取，源材料采集时间和地点、培养基种类、提取缓冲液、提取方式、保存剂、保存温度等诸多影响因素的存在使得变应原浸液的蛋白组分、比例和含量、生物效价在不同厂商、同一厂商不同批号之间有很大变异。各卫生组织、药品管理部门、以及各大医学协会都有指导文件明确推荐应该选用安全性和有效性确定的、获得许可证的、合格的变应原产品，而且优先选用标准化的变应原产品，使变应原特异的免疫治疗在医疗实践中能达到WHO关于医疗保健的质量定义，即“高度的专业诊断标准”、“有效的利用资源”、“患者承担风险最低”、“患者高度满意”、“以及患者治疗的连续性”。

变应原标准化一个方面关注变应原浸液总体生物效价，另一方面则是关注单一变应原的含量，尤其是主要致敏蛋白的含量。近年来随着大量变应原蛋白被鉴定和纯化，以主要致敏蛋白含量测定作为变应原产品质量控制的方法逐步在实际中运用，ELISA作为一种简单、适用、易于标准化的方法用于检测主要致敏蛋白方面已有大量文献发表。以单抗分别作为捕获抗体和检测抗体的双位点夹心ELISA法其灵敏度达到ng水平，该方法比放射免疫扩散法(RID)和竞争ELISA法检测限低100到1000倍。利用该法定量欧洲橄榄主要致敏原Olee1，其敏感度为1ng/ml，测试范围为1 to 25ng/ml.。

由于葎草花粉由于地理分布广、流行病学意义重大而倍受国内外研究者重视。在国内李东栋等对武汉地区葎草花粉变应原蛋白质组分的进行了双向电泳分析，孙秀珍等对葎草花粉变应原致敏组分进行了研究；刘昀等构建葎草和初步鉴定了花粉cDNA表达文库，陶爱林等创建了葎草及豚草过敏原的嵌合基因，并对其抗原性作出评价等等。但一直以来，对于葎草主要变应原一直没有足够的认识。直至最近，率先由北京协和医院变态反应科尹佳等纯化、克隆、鉴定一个葎草花粉致敏蛋白，其过敏患者血清sIgE结合率约为74％，确定为葎草主要致敏蛋白，拟定名为Hum j3。该蛋白对应的cDNA全序列在GenBank accession number中的序列接受号为：FJ967117，而其蛋白全序列在UniProt Knowledgebase中的序列接受号为：P86278。

然而到目前为止，还没有建立一种能够简便高效检测Hum j3的方法。

发明内容

本发明的目的提供一种用于检测葎草花粉主要致敏蛋白Hum j3试剂盒，已达到简便高效检测Hum j3的目的。

本发明试剂盒是以小鼠杂交瘤单抗和天然葎草花粉纯化主要致敏蛋白Hum j3为基础建立的，具体地说包括如下步骤：

1)通过纯化主要致敏蛋白Hum j3免疫BALB/c小鼠，制备多株小鼠杂交瘤单抗；