[发明专利]一种新的快速定性和定量检测蓖麻毒素的胶体金免疫层析方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及蓖麻毒素的检测快速定性和定量检测方法以及胶体金免疫检测试纸条。

背景技术

蓖麻毒素(ricin toxin，RT)是一种从蓖麻种子的胚乳中提取的植物蛋白毒素。由于RT来源广泛，毒性较强，已被外军作为武器化的一种毒素加以研究。禁止化学和生物武器公约把RT列为最严格的控制对象之一。自美国“9.11”恐怖袭击之后，随着多个恐怖组织和极端分子研制、拥有并携带RT惊现英国首都伦敦，使这种致命的毒素成为最有可能被用作恐怖袭击的生物毒素，而引起国际上的广泛关注。为应对生物恐怖，开展对RT的检测研究具有十分重要的意义。

蓖麻毒素自发现之日起，其毒性就被人们所知，到目前位置文献报道蓖麻毒素中毒病例已超过750例，人们对它的研究就一直没有停止过。其中最著名的“马克夫毒伞案”中，叛逃到英国的保加利亚作家马克夫，就是被保加利亚特工用前苏联装有RT的特制雨伞毒杀的近代，欧美国家开始将RT用作常规武器进行研制。同时，作为生物恐怖战剂，RT的获得又极其容易、廉价。根据检出结果分析，研制的蓖麻胶体金试纸条检测系统最低可检到1ug/ml，而人致死量约为7mg。试纸条的灵敏度完全能检测到可疑物中是否含有蓖麻毒素的存在，检验的可行性。可以先从蓖麻种子中获得粗毒，然后利用其对半乳糖的特殊亲和力，采用琼脂糖4B柱吸附，用半乳糖洗脱，再用纤维素离子交换柱层析或葡聚糖凝胶过滤进一步纯化；或是根据常规基因工程技术，利用基因克隆的方法来制备RT。由于气溶胶化的RT微粒无色无味，不易被发现，因此侦检非常困难。

最初是用动物实验测定RT的毒性和定量检测。现阶段根据RT所具有的理化特性、生化特性和免疫原性发展出多种检测方法，其中以免疫检测法为主。免疫检测法多是依赖于抗原抗体反应的免疫学方法，包括多克隆和(或)单克隆抗体为基础的放射免疫法或酶联免疫吸附法(ELISA)，免疫层析试验和电化学发光生物传感器，其中ELISA法是国际规定的检测RT的金标准[14]。此类方法具有高效、灵敏、样品用量少(pmol-μpmol)、自动化等特点，但缺陷是需要昂贵的仪器设备，且周期长、操作繁琐等缺点，并不适合广泛应用，只适合在实验室应用。

本发明提供一种快速定性和定量检测蓖麻毒素的胶体金免疫层析方法，该方法操作简单，检测时间短，无需专业人员，适合快速现场检测。

发明内容

本发明提供一种快速定性和定量检测蓖麻毒素的胶体金免疫层析方法。本发明采用胶体金标记，实质是抗体蛋白等生物大分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。

胶体金对蛋白质的吸附主要取决于pH值和蛋白质的最小稳定浓度，离子浓度和蛋白质分子量等也影响二者之间的吸附。本发明发现在胶体金检测试纸条的制备过程中pH值条件是关键，因为胶体金是一种很不稳定的胶体，而pH值条件对胶体金探针的影响最大。通常认为，在pH值等于蛋白质等电点或较高于等电点时吸附效果最好，易形成牢固的复合物而稳定胶体金。我们将胶体金标记技术应用于免疫层析法时要根据实验需要，选择不同直径大小的胶体金颗粒，来保证较高的灵敏度和稳定性。一般做胶体金检测试纸条用的胶体金颗粒在20nm到50nm之间。过大可见度高，但稳定性不是很好；过小又影响敏感性。在本发明中尝试过使用25nm和40nm的胶体金，在对不同的检测对象中使用。例如参见：王俊红，康林.“蓖麻毒素及其检测”，中国检验卫生杂志，2007年2月第17卷第2期。胶体金颗粒大小对检测试纸条的影响很大，而它的颗粒大小要靠还原剂来调节。具体是氯金酸在还原剂如：柠檬酸三钠、枸橼酸钠等作用下，聚合成特定大小的金颗粒。利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质的正电荷基团借静电吸引而形成牢固结合。用于标记的蛋白质多为抗体，我们选用纯化的抗体作为金标的标记蛋白。另外，在喷膜时，抗体需要加入封闭剂，如果不加在检测阴性时会出现非特异性，喷膜完毕应立即将NC膜放入烘箱以免T、C线发生扩散。

本发明的目的是提供一种方便、快捷地检测蓖麻毒素的试纸，同时可利用金标免疫分析仪进行的半定量检测方法。该试纸的工作原理是利用特异性抗原-抗体的结合，用胶体金标记抗体，与待检抗原结合后，使与试纸上结合的捕获抗体显色。本发明还涉及制备上述检测试纸的制备方法。

本发明能够基于一份标本和一个试纸，快速方便地检测出标本中的蓖麻毒素，节省了大量人力物力，方便、快速、简捷。

一种方便、快捷地检测蓖麻毒素的方法，其中包括将待测标本与样品稀释液混匀，再将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判读结果；所述检测试纸包括：