[发明专利]一种使用聚酰胺氢键吸附色谱分离纯化胸腺五肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种胸腺五肽的分离方法，具体的是涉及一种使用聚酰胺氢键吸附色谱分离纯化胸腺五肽的方法。

背景技术

胸腺五肽(TP5)是一种人工合成多肽，其氨基酸顺序和结构与胸腺生成素(TP)中第32-36位的氨基酸组成相同，它的基本序列为H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。胸腺五肽是胸腺生成素的重要功能活性部分，具有与其相似的生物活性。TP5能够诱导T细胞分化，促进T淋巴细胞亚群发育并活化，对机体的免疫功能具有双向调节作用，能使过高或过低的免疫反应趋向正常。动物实验和临床研究证明胸腺五肽对免疫功能低下和自身免疫病患者的免疫功能具有重要的调节作用。目前，胸腺五肽在临床上主要应用于免疫缺陷、自身免疫性疾病、传染病、肿瘤和艾滋病等疾病。

胸腺五肽的合成包括液相合成法和固相合成法两种。在TP5液相合成过程中，由于每次接肽后都需要对产物进行分离纯化或结晶以便除去未反应的原料和副产物(申请号031343554)，这增加了操作步骤和复杂性，并导致最终收率较低，因此，胸腺五肽的合成多采用固相合成法。传统的胸腺五肽固相合成法是利用Merrifield树脂和叔丁氧羰基保护的酪氨酸反应生成酪氨酸树脂，以此为起始原料，依次保护缬氨酸、天冬氨酸、赖氨酸和精氨酸起缩合反应，生成保护TP5树脂，在用液态氟化氢将其从树脂上脱除以获得胸腺五肽粗品。但是由于该方法采用液态氟化氢作为作为TP5树脂的脱除剂，使得反应条件苛刻且较为危险，因而人们在此基础上进行了一些改进，如用溴乙酰胺树脂(Int.J.Peptide Protein Res.28，1986，22-28)或wang树脂(CN1534042A)作为新的固相载体进行合成以获得大量的胸腺五肽粗品。

但是，合成所得的胸腺五肽粗品中还含有部分杂质，因此仍需纯化后才能应用于临床治疗。作为化学合成多肽，胸腺五肽的分离纯化方法以离子交换色谱法和反相液相色谱法为主。一些研究者采用离子交换凝胶SP Sepharose FF，在pH 4.4的醋酸缓冲体系中分离TP5，经HPLC检测纯度为98.23％，纯化收率为67.03％(南京工业大学学报，2005，27(2)：13-17.)另外，也有研究者采用C18柱，以三乙胺磷酸甲醇体系作为流动相进行分离。随后用sephadex G25柱脱盐后获得的纯度在90％以上，回收率也相对较高(CN1733797A)。这些方法存在分离介质价格昂贵、担载量低、分离设备要求高等缺点，尤其是RP-HPLC大规模分离多肽时，会产生大量的有机溶剂，既是影响环保，又增加后处理成本。另有研究者采用离子交换、纳滤和结晶相结合的工艺进行分离，纯化后TP5的纯度为99.12％，但由于操作步骤较多，其最终收率仅为48.35％(高校化学工程学报，2008，22(4)：709-713)。因此，仍需一种成本合算且操作简单的胸腺五肽纯化工艺。

发明内容

本发明方法针对目前纯化工艺中所存在的纯化效率和回收率低以及纯化成本较高等诸多问题，通过聚酰胺氢键吸附色谱一步分离纯化获得较高纯度的胸腺五肽。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的。

本发明提供一种使用聚酰胺氢键吸附色谱分离纯化胸腺五肽的方法，具体步骤如下：

1)胸腺五肽合成物离心去除可见颗粒物；

2)取聚酰胺粉末，加入95％乙醇于室温110转/分钟振荡洗涤40-50分钟，倾出95％乙醇，用水洗至无醇味，再分别用5％氢氧化钠溶液及30％乙酸溶液按相同方法洗涤，最后用20％乙醇洗涤，装柱平衡至初始流动相，采用干法或湿法装填成柱；

3)聚酰胺氢键吸附色谱流动相包括水，乙醇-水，乙醇-乙酸-水，乙醇-三氟乙酸-水，甲醇-水，甲醇-乙酸-水，甲醇-三氟乙酸-水，乙腈-水，乙腈-乙酸-水，乙腈-三氟乙酸-水等体系，采用不同溶剂配比；流动相超声脱气或真空脱气10-30min，室温静置0.5-1h；

4)洗脱方式包括等度洗脱、线性梯度洗脱和分步洗脱；

5)采用初始流动相平衡聚酰胺色谱柱两个柱体积，线性流速0.1-10ml/min，紫外检测器210-280nm或采用示差检测器在线监测，自动收集馏分；

6)将步骤8)收集的馏分干燥后用C18分析柱检测纯度，并计算回收率。

本发明提供了一种使用聚酰胺色谱分离胸腺五肽的方法，该方法与现有技术相比具有以下优势：一步分离可获得较高纯度的胸腺五肽，回收率高；工艺过程操作简单，成本低；介质对粗样品耐受强，样品载量高，介质可多次重复利用，易于规模放大，生物安全性好。

附图说明