[发明专利]一种利用细菌发酵生产丙烯酸的方法

权利要求书

1、一种利用细菌发酵生产丙烯酸的方法，它包括如下步骤：

(1)菌株选择：埃氏巨球形菌，中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC，No1.2720；

(2)斜面培养：麦芽汁液体培养基：麦芽汁体积百分浓度为7％，pH自然，灭菌121.3℃，20分钟；将上述筛选出的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于麦芽汁液体培养基33～40℃恒温培养8～24小时；

(3)一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于发酵培养基中，33～40℃条件下，在摇床上振荡培养24～48小时，制得一级种子；

(4)扩大培养：按体积比10％的接种量，接一级种子于发酵培养基中，添加四种体积百分浓度为0.015％～0.150％的电子受体水溶液之一，33～40℃条件下，在摇床上振荡培养24～96小时，制得二级发酵液；所添加的四种电子受体分别为：亚甲基蓝、联苯醌、甲萘醌和蒽醌，

(5)收集菌体：取步骤(4)的发酵液，在80，000～10，000转/分条件下离心15-20分钟，收集沉淀菌体，并用质量百分浓度为0.7％的氯化钠溶液洗涤2～3次，湿菌体在4℃储存，备用；

(6)丙烯酸的提取：选用氯仿萃取法进行菌体内丙烯酸的提取：将菌体用蒸馏水重悬，超声波破碎后，离心得粗丙烯酸溶液，之后按体积比为1∶1的比例加入三氯甲烷，45℃震荡萃取4小时，静置分层，取下层即为丙烯酸样品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中涉及的液体发酵培养基配方是：牛肉粉2.4g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母膏5.0g/L，Na₂HPO₄4.0g/L，葡萄糖1.5g/L，可溶性淀粉0.5g/L，L-半胱氨酸-HCl·H₂O 0.5g/L，其他为去离子水；此液体发酵培养基除L-半胱氨酸-HCl·H₂O外，均121.3℃，pH7.5，灭菌20分钟；L-半胱氨酸-HCl·H₂O用0.22um微孔滤膜过滤除菌。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中涉及的发酵培养基：KH₂PO₄0.5g/L，NH₄Cl 0.5g/L，MgCl₂·6H₂O 0.5g/L，可溶性淀粉20.0g/L，葡萄糖13.0g/L，酵母膏4.0g/L，巯基乙酸；此发酵培养基除巯基乙酸外均121.3℃，pH7.5，灭菌20min；巯基乙酸0.22um微孔滤膜过滤除菌。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述的培养温度是37℃，培养时间是96小时；添加浓度为0.015％。