[发明专利]一种原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测(免疫化学分析技术)领域，涉及一种酶联免疫检测方法及 试剂盒，具体涉及一种用于检测原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法及试剂 盒。

背景技术

牛奶和牛奶制品是大自然赐予人类最理想的、最接近于人奶的天然食品。牛奶的化学 成分很复杂，至少有100多种，主要成分由水、脂肪、磷脂、蛋白质、乳糖和无机盐等组成。 人体蛋白质的氨基酸有20种，其中有8种是人体本身不能合成的，这些氨基酸称为必需氨基 酸。牛奶中的蛋白质包含了所有的必需氨基酸。所以牛奶制品中的蛋白质含量是评价牛奶 质量好坏的一项重要指标。

根据我国灭菌乳GB54082-1999对乳及乳制品质量控制指标，要求100g奶中蛋白质的 含量≥2.9g。由于目前国标GB/T 5009.5-1985中规定蛋白质的标准检测方法为凯氏定氮法， 其方法是通过检测氮的含量推算得到蛋白质含量，对于氮源不具备识别能力。有一些人通 过添加三聚氰胺、尿素等含氮的化学物质或廉价蛋白质来提高牛奶中的“蛋白”含量，以 次充好。就加入三聚氰胺C₃H₆N₆而言，其中N的含量是66.66％，而从氮元素计算出乳制 品中蛋白质的含量为6.38×66.66％＝425％。也就是说1g三聚氰胺中含有4.25g蛋白质， 也正是这样的暴利驱使得掺假问题屡禁不绝。面对凯氏定氮法存在的局限性，市场上还有 通过测定酪蛋白的含量来判断牛奶中是否掺假的测定方法，但是由于牛奶中的蛋白主要为 酪蛋白、乳清蛋白等，单独选用酪蛋白作为蛋白质的评价指标也存在一定的局限性。

因此，急需发展一种新型完善的直接检测牛奶及牛奶制品中蛋白质含量的方法，作为 评定牛奶的质量和判定牛奶中是否掺假的指标。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供了一种用于检测原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶 联免疫检测方法及试剂盒，增强了特异性、灵敏度和准确性，能满足企业对原料乳和乳制 品的质量检测和监督。

本发明的技术方案：

一种原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法，包括以下步骤：

(1)包被：Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH 9.6)稀释混合蛋白(4～5μg/mL酪蛋白和2～2.5 μg/mL β-乳球蛋白混合液，混合比例2∶1)配制混合蛋白包被液，包被96孔酶标板，每孔 100μL，4℃放置过夜；

(2)封闭：弃去包被液，每孔加入150μL封闭液(5％(w/w)以上豆粉，超声3min以上， 2000rpm离心5min以上，取上清)，放置恒温恒湿细胞培养箱37℃，孵育2h以上；

(3)抗原抗体反应：弃去封闭液，用洗涤液PBST洗涤。将混合蛋白梯度标准品或待测 样品加入酶标板微孔，每孔50μL。再加入混合蛋白抗体(酪蛋白抗体和β-乳球蛋白抗体 以等比例混合制备的混合蛋白抗体，混合比例1∶1)，每空50μL，37℃恒温恒湿培养箱， 孵育0.5h以上；

(4)抗原抗体复合物与酶标二抗反应：弃去反应液，酶标板用PBST洗涤，加入酶标二 抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)，每孔100μL，37℃恒温恒湿培养箱，孵育0.5h 以上；

(5)显色：弃去反应液，用PBST洗涤，显色液A(10mg邻苯二胺溶于25mL 0.05M 的磷酸盐-柠檬酸缓冲液，pH 5.0)与显色液B(40％双氧水)按600～700∶1比例混合，每孔 加入100μL混合显色液，恒温恒湿培养箱37℃，孵育25min；

(6)终止反应：酶标板每微孔加入50μL终止液(1～2mol/L盐酸)，终止反应；

(7)测定：用酶标仪于492nm波长下测量各孔的吸光度值OD值。

(8)根据检测结果绘制标准曲线，横坐标为各标准混合蛋白浓度的对数，纵坐标为抑 制率(各标准品孔和样品孔吸光度值除以0ng/mL标准品孔吸光度值)。

(9)对照标准曲线，带入线性回归方程，得到酪蛋白-乳球蛋白的总蛋白含量，根据酪 蛋白-乳球蛋白占总蛋白含量，计算全蛋白含量。