[发明专利]一种原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种对原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法，包括以下步骤：

(l)包被：Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，稀释混合蛋白配制混合蛋白包被液，包被96孔酶 标板，每孔100μL，4℃放置8小时以上；

(2)封闭：弃去包被液，每孔加入150μL封闭液，放置恒温恒湿细胞培养箱37℃，孵 育2h以上；

(3)抗原抗体反应：弃去封闭液，用洗涤液PBST洗涤；将混合蛋白梯度标准品或待测 样品加入酶标板微孔，每孔50μL；再加入混合蛋白抗体，每孔50μL，37℃恒温恒湿培养箱， 孵育0.5h以上；

(4)抗原抗体复合物与酶标二抗反应：弃去反应液，酶标板用PBST洗涤，加入酶标二 抗，每孔100μL，37℃恒温恒湿培养箱，孵育0.5h以上；

(5)显色：弃去反应液，用PBST洗涤，显色液A与显色液B按600～700:1比例混合， 每孔加入100μL混合显色液，恒温恒湿培养箱37℃，孵育25min；显色液A为10mg邻苯 二胺溶于25mL0.05M的磷酸盐一柠檬酸缓冲液，pH值为5.0；显色液B为40%双氧水；

(6)终止反应：酶标板每微孔加入50μL的l～2mol/L盐酸，终止反应；

(7)测定：用酶标仪于492nm波长下测量各孔的吸光度值OD值；

(8)根据检测结果绘制标准曲线，横坐标为各标准混合蛋白浓度的对数，纵坐标为抑制 率；所述抑制率为各标准品孔和样品孔吸光度值除以0ng/mL标准品孔吸光度值；

(9)对照标准曲线，带入线性回归方程，得到酪蛋白和β-乳球蛋白的总含量，根据酪蛋 白和β-乳球蛋白占全蛋白的含量，得到全蛋白含量；

所述步骤(1)中，稀释混合蛋白包括4～5μg/mL酪蛋白和2～2.5μg/mLβ-乳球蛋白混合液， 混合比例：2:1；

所述步骤(2)中，封闭液为5%(w/w)以上的豆粉，进行超声3min以上，2000rpm离心5min 以上，取上清得到；

所述步骤(3)中，混合蛋白抗体为酪蛋白抗体和β-乳球蛋白抗体以等比例混合制备的混合 蛋白抗体，混合比例为1:1；混合蛋白标准品为酪蛋白和β-乳球蛋白标准品按8:1浓度比例混 合，逐级稀释成140.6ng/mL、281.2ng/mL、562.5ng/mL、1125ng/mL、2250ng/mL、4500ng/mL、 9000ng/mL、18000ng/mL、36000ng/mL、72000ng/mL，稀释液为PBST；洗涤液为含有吐 温20的磷酸盐缓冲液PBST；

所述步骤(4)中，酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔lgG。

2.一种对原料乳和乳制品中总蛋白含量酶联免疫检测的试剂盒，所述试剂盒用于如权利 要求1所述的酶联免疫检测方法，其特征在于：包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体 内的试剂，所述酶标板为96孔包被的酶标板；在酶标板的每孔内，包被有酪蛋白和β-乳球蛋 白混合得到的混合蛋白抗原；所述的试剂包括混合蛋白标准品、混合蛋白抗体干粉，酶标记 羊抗兔抗体干粉、洗涤液、显色液A、显色液B和终止液。

3.如权利要求1所述的一种原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法，其特征 在于：所述步骤(3)中的待测样品，需进行前处理，处理方法为液态奶制品经过15,000rpm离 心5min以上，除去上层油脂层后，混合，稀释20,000-25,000倍；奶粉样品稀释至4～6μg/mL： 稀释液为PBST。