[发明专利]一种双特异抗肿瘤重组腺病毒及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和基因领域，具体涉及一种双特异抗肿瘤重组腺病毒及其构建方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤的发展是多因素参与的动态过程，若未及时发现并采取有效控制措施，其强大繁殖能力所导致的惊人蔓延速度将成为所有疗法必然面对的挑战。此时，如何有效清除恶性肿瘤是患者生命的最后防线。

多年来对肿瘤基因治疗研究的经验表明，怎样在与恶性肿瘤的竞速中取得完胜是实现绝地反击的关键。因此，可以得出恶性肿瘤无坚不摧，但唯快不破的结论，即无论恶性肿瘤如何肆虐，只要实现快速抑瘤，从而使抑瘤过程在恶性肿瘤发展的动态平衡中占得上风，就能达成治疗恶性肿瘤的目的。

当然，上述唯快不破的结论是以安全性为基础的。无疑，手术治疗、化疗和放疗是目前肿瘤治疗的首选方式，而上述疗法对机体的不可逆创伤和对生理的次生影响却如饮鸩止渴，令所有人谈之色变。目前，肿瘤基因治疗研究应摒弃拆东补西的传统方案，通过将特异性作为研究重点来夯实候选药物的安全性基础。

多数化疗药物和射线通过p53发挥作用，而各类肿瘤中50％～60％存在p53突变，从而严重影响治疗效果。另外，bcl-2可抑制细胞凋亡，从而成为一些肿瘤化疗耐药的物质基础。因此，如何在抗肿瘤候选药物研究伊始即着眼解决耐药问题，也是抗肿瘤药物研发成功与否的关键之一。

恶性肿瘤超过100种，几乎可以发生在身体任何部位。全世界70％的恶性肿瘤死亡病例发生在中低收入国家，发达国家以不计成本的方式治疗只能将个别恶性肿瘤类型的5年平均生存率提高至50％～60％。虽然宫颈癌、乳腺癌和结肠癌等恶性肿瘤，若发现及时，辅以适当疗法，可以得到有效治疗。但在欠发达国家，由于公共卫生水平、医疗质量和诊治费用等诸多限制，这些极易控制的恶性肿瘤也难以得到有效治疗，这已使中国成为名副其实的“癌症大国”。研发高效、安全、廉价的抗肿瘤新药是惠国利民之举，已成当务之急。

总之，对于恶性肿瘤，人们需要更迅速、更特异、更安全、更温和、更广谱、更经济和无耐药之忧的治疗方式，这种渴望催生了全世界科研工作者数十年的孜孜以求。

研究表明，hTERTp(人端粒酶逆转录酶启动子)在肿瘤细胞系中明显激活，除了干细胞、生殖细胞、活化的淋巴细胞外，hTERTp的活性几乎仅限于肿瘤细胞。如此，hTERTp可实现目的基因表达的肿瘤特异性。基于此构建hTERTp调控的自杀基因、药物前体激活基因和抑瘤基因的各类肿瘤生物治疗制剂，具有对肿瘤高特异和对正常细胞低毒的优势，已成为肿瘤特异性基因治疗的研究热点。

研究发现，Apoptin能够在不影响正常细胞的前提下，在8～12小时内特异性地诱导肝癌、淋巴瘤、血液系统肿瘤、乳腺癌、肺癌细胞和鳞状细胞癌等多种肿瘤细胞发生凋亡。另外，无论肿瘤细胞的p53基因是否存在突变，Apoptin均可有效诱导肿瘤细胞凋亡。并且，bcl-2的过表达不仅对Apoptin的凋亡诱导作用无影响，反而能增强Apoptin的凋亡诱导功能。值得说明的是，bcl-2对Apoptin所诱导凋亡的促进作用不是这两者直接作用的结果，因为正常细胞即使过表达bcl-2，Apoptin也不会对其产生影响。Apoptin的应用将大大降低产生耐药性的可能。

传统重组腺病毒污染RCA往往发生在穿梭载体与基因组骨架在含E1基因的293细胞内重组过程中。有时RCA污染比例很高，不得不经过额外的、耗时的蚀斑纯化过程以纯化重组腺病毒。研究发现，腺病毒基因组骨架若缺失包装必需信号，可有效降低RCA污染的可能性，从而避免蚀斑纯化过程。

发明内容

本发明目的在于针对现有抗肿瘤药物的缺陷，提供一种新型双特异抗肿瘤重组腺病毒，用于肿瘤的治疗和预防。

本发明另一目的在于提供上述重组腺病毒的构建方法。

本发明的再一目的在于提供双特异抗肿瘤重组腺病毒在制备预防和治疗肿瘤药物方面的应用。

本发明抗肿瘤重组腺病毒，其包括腺病毒载体和引入其中的表达盒，所述腺病毒载体的复制必须基因突变，所述表达盒包括由肿瘤特异性启动子与E1a基因组成的表达盒和由真核启动子与Apoptin基因组成的表达盒。

所述腺病毒载体的基因组左侧ITR和包装信号区缺失。

所述肿瘤特异性启动子为hTERTp(人端粒酶逆转录酶核心启动子)或PEG-3p启动子等。

所述真核启动子为任意一种真核启动子，比如CMV启动子(人类巨细胞病毒启动子)，当然也可以采用肿瘤特异性启动子。

所述腺病毒载体源自为人5型腺病毒。