[发明专利]一种可定量检测鼠疫耶尔森菌的蛋白质悬浮芯片方法

权利要求书

1、一种采用双抗体夹心免疫学检测模式检测鼠疫耶尔森菌(Y.pestis)的方法，其特征在于，检测过程中全部反应可在96孔滤板或者微量离心管中进行，该方法包括下列步骤：

(1)向孔加入含已包被抗体编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；

(2)加入待测样品，孵育后清洗；

(3)加入用生物素化的检测抗体，孵育后清洗；

(4)加入SA-PE，孵育后清洗；

(5)加入检测缓冲液后混匀；

(6)用悬浮芯片系统读取平均荧光强度(FMI)数值并分析数据。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，用于包被微球的抗体选自以下中的一种或多种抗体：(1)兔抗鼠疫菌EV76抗体；(2)羊抗鼠疫菌EV76抗体；(3)兔抗鼠疫菌F1抗原的抗体；(4)鼠抗鼠疫菌F1抗原的IgG，单抗2F6、5G12、2H12；(5)羊抗鼠抗体；(6)鸡IgG；(7)兔抗鸡IgG。

3、如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的包被微球的抗体及其用量选自：16μg单抗5G12、24μg单抗2H12和16μg兔抗EV76、10μg羊抗EV76以及10μg、40μg的兔抗体中的一种或多种。

4、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物素化的检测抗体选自生物素化的鼠疫菌F1单抗2F6、5G12、2H12。

5、如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用微球标记的兔抗F1为捕获抗体，采用生物素标记的单抗2F6作为检测抗体，其组合。

6、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中的生物素为羧基活性的生物素。

7、如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：

1)向普通ELISA微孔板每孔加入用PB缓冲液稀释的捕获抗体，静止过夜；加入封闭液封闭；

2)加入检测样品，室温放置，洗涤；

3)加入生物素化检测抗体，室温放置，洗涤；

6)加入适量辣根酶标记链霉亲和素，室温放置，洗涤；

7)加入TMB显色液，即可溶型单组分TMB底物溶液显色，室温放置；

8)用2M H₂S0₄终止反应；应用酶标仪测读A_450nm数值。

8、一种定量检测鼠疫耶尔森菌(Y.pestis)的蛋白质悬浮芯片方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

(1)加入的阳性检测样品或标准品经梯度倍比稀释，所述梯度倍比稀释为2倍、4倍、5倍或10倍；

(2)制作样品浓度对应FMI值的剂量-反应曲线；

(3)用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程；

(4)未知浓度样品可根据剂量-反应曲线和方程判断样品检测浓度，可判定方法检测限。

9、如权利要求8所述的方法，其特征在于，在测定待测样品的FMI数值时包括以下的步骤：

1)加入含相应编码微球的工作溶液，洗涤；

2)加入待测样品，混匀后室温避光震摇，洗涤；

3)加入适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混匀后室温避光震摇，洗涤；

4)加入辣根酶标记链霉亲和素，室温避光震摇，洗涤；

5)加入的检测缓冲液，经VOTEX重悬混匀，用Bio-Plex悬浮芯片系统读取FMI数值并分析数据。

10、如权利要求8所述的方法，其特征在于，用于包被微球的抗体选自以下中的一种或多种抗体：(1)兔抗鼠疫菌EV76抗体；(2)羊抗鼠疫菌EV76抗体；(3)兔抗鼠疫菌F1抗原的抗体；(4)鼠抗鼠疫菌F1抗原的IgG，单抗2F6、5G12、2H12；(5)羊抗鼠抗体；(6)鸡IgG；(7)兔抗鸡IgG。

11、如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的包被微球的抗体及其用量选自：16μg单抗5G12、24μg单抗2H12和16μg兔抗EV76、10μg羊抗EV76以及10μg、40μg的兔抗体。

12、如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述生物素化的检测抗体选自生物素化的鼠疫菌F1单抗2F6、5G12、2H12中的一种或多种。