[发明专利]一种从王不留行中分离制备具有增乳活性单体的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及天然药物化学和生物细胞学，具体说就是一种从王不留行中分离制备具有增乳活性单体的方法。

(二)背景技术

我国中草药资源丰富，中药用于增奶，具有毒副作用小、价格低、无抗药性、无残留等独特优势。将中草药作为增奶剂和饲料添加剂的研究最早源于我国，目前已经有许多增奶方剂用于饲料添加剂来提高奶牛产乳量，同时一些增乳的天然中药及其制剂在临床上也已广泛应用。Dugoua等(2006，2009)系统阐述了增乳中药的药理学性质，对增乳中药在妊娠和泌乳临床应用中的正确性和安全性进行了评价。

王不留行(Semen Vaccariae)为石竹科植物麦蓝菜的种子，为传统常用中药。王不留行作为重要的增乳中药，其所含成分种类多，成分复杂。天然药物有效性的物质基础在于它的有效成分。因此若想探明王不留行的增乳机理就需要寻找到其中具有增乳活性的单体成分，才能通过含量测定的方法控制天然药物及其制剂的质量，从而更好的研究其药效动力学及药代动力学，对王不留行增乳活性成分的开发利用具有重要的理论和实际价值。从中药复方的药味筛选到成分筛选是中药药效研究的主流。利用细胞培养技术筛选中药药效成分是十分快捷有效的方法。随着天然药物化学技术的研究进展，邻苯二甲酸二丁酯从一些天然活性物质中分离获得。韦松等(1997)从苋科牛膝属植物怀牛膝分离制备鉴定出7种化合物，其中包括邻苯二甲酸二丁酯。周忠波等(2007)发现红柳中含有邻苯二甲酸二丁酯成分。韩志慧等(2006)发现山茱萸中含有邻苯二甲酸二丁酯成分。此外具有增乳效应的漏芦中也含有邻苯二甲酸二丁酯。由于生态环境与陆地生物迥异，海洋生物中蕴藏着大量结构独特的活性物质，海洋天然产物成为目前天然药物化学研究中最活跃的领域之一。史大永等(2005)对基根硬毛藻的化学成分进行分离纯化，鉴定出其中含有邻苯二甲酸二丁酯。孙奕(2008)从绿藻从石莼中分离得到8个化合物，其中包括邻苯二甲酸二丁酯。曲新颜等(2004)从海洋来源的放线菌代谢产物分离制备出邻苯二甲酸二丁酯，且其具有抗肿瘤活性。邻苯二甲酸二丁酯是一种环境雌激素，具有雌激素生物样的生物活性。近年的一些研究表明，对羟基苯甲酸酯体外实验具有弱雌激素活性，能与雌激素受体(ER)结合。关于邻苯二甲酸二丁酯生物活性的研究报道较少，一些体内试验的结果表明邻苯二甲酸二丁酯生物可以对促进子宫增重具有一定作用(杨波等，2002)。邻苯二甲酸二丁酯可促进雌激素依赖性乳腺癌MCF-7细胞的增殖，可能具有拟雌激素作用(靳秋梅等，2005)。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种制备方法简便、纯度高、成本低的从王不留行中分离制备具有增乳活性单体的方法。

本发明的目的是这样实现的：从王不留行中分离制备具有增乳活性单体的方法步骤如下：

步骤一：王不留行粗提取：取王不留行粗粉10kg，用体积分数70％的乙醇加热回流提取3次，每次2h，减压回收溶剂，稀释母液，依次以乙醚、乙酸乙酯萃取，获得乙酸乙酯萃取部位。

步骤二：王不留行提取物活性部位的筛选：对乙酸乙酯部位进行聚酰胺柱层析，干法上样，分别用水，10％，30％，50％，70％，95％乙醇系统进行梯度洗脱，收集不同梯度洗脱液，旋转蒸发后获得不同洗脱部位的中药成分，通过其对奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型细胞活力、乳糖及乳蛋白分泌能力的影响确立50％的乙醇洗脱部位为王不留行增乳活性部位。

步骤三：王不留行增乳单体的制备：对50％的有效部位进行进一步的分离纯化，对聚酰胺柱层析分离获得的50％乙醇洗脱部位进行硅胶薄层层析，根据硅胶G板的薄层结果的Rf值情况选择摸索不同的溶剂系统，最终确立石油醚-乙酸乙酯系统为有效分离系统，采用石油醚-乙酸乙酯系统对50％乙醇洗脱部位进行硅胶柱层析，对分离的化合物进行筛选，其中石油醚∶乙酸乙酯20∶1的洗脱流分中含有一个具有增乳活性的单体成分；对该增乳单体化合物的制备采用分析型和制备型HPLC法进行，采用10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的甲醇对单体化合物的粗品进行紫外全波长扫描进行检识，确立此化合物的紫外吸收波长为275nm，采用半制备型HPLC对化合物连续进样以纯化并制备出高纯度的目的化合物。