[发明专利]β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白及其用途

说明书

技术领域

本发明属于微生物转化工程技术领域，涉及β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白及其用途。更具体的说是利用β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白对陈皮进行生物转化可提高陈皮中橙皮苷的生物利用度的方法。

背景技术

生物转化法本质是由微生物产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂对外源性底物进行的一种或几种化学反应。生物转化既可增加目标产物产量，克服化学合成的缺点，又因其大多数是在室温、中性环境中作用，减少了产物分解、异构、消旋和重排反应，反应具有位置选择性和立体选择性，因此生物转化具有无毒、无污染、低成本、高收率、环境友好等特点。

S.Singularis分离自Scolytus spp.昆虫幼虫粪便，由于此类真菌自然条件下的生存环境决定了其体内可产生用于分解来自于蔬菜的苷类化合物的酶类。Ishikawa EIJI等研究发现S.Singularis只能产生一种水解酶，称作BglA蛋白，并验证此酶是具有高半乳糖苷酶活性的β-葡萄糖苷酶同工酶。

橙皮苷是广泛存在于柑橘类果实中主要类黄酮苷类成份之一，药理研究证实其具有抗氧化、调节脂类代谢、干扰肿瘤发生等生物活性。但橙皮苷与其他类黄酮一样口服生物利用度不高，究其原因之一是其含有的配糖基团影响了其水溶性。相关研究表明橙皮苷的苷元，橙皮素的口服生物利用度高于橙皮苷，因为橙皮素不含有配糖基团，不需要脱糖基化。因此水解橙皮苷，脱去其配糖基团是提高其口服生物利用度的特异性方法之一。目前研究的转化方法主要有化学法，如日本Hayashibara橙皮研究所采用糖基化方法制成糖基化橙皮苷。但强烈化学反应会改变苷类化合物的结构和构型，导致产物不稳定或药效消失；酶解法，如瑞士雀巢研究中心采用酶修饰方法，用橙皮苷酶水解橙皮苷获得橙皮素-7-糖苷。酶解法转化苷类中药是以苷类提取物为作用底物，使用糖苷水解酶作为催化剂，工艺过程复杂，不利于工业化生产。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供一种β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白。本发明使用β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白生物转化陈皮中的主要活性成分橙皮苷，口服给药和静脉给药两种给药途径的药代动力学结果均表明此酶的生物转化作用提高了橙皮苷的生物利用度，因此我们探索微生物转化技术，利用ATCC标准真菌菌株S.singularis，采用现代分子生物学技术，克隆、表达具有高β-葡萄糖苷酶活性的BglA蛋白，利用其生物转化橙皮苷，将苷转化为苷元，消除苷类中药人群中应用个体差异，提高苷类中药生物利用度，进而提高苷类中药药效。

本发明的另一个目的在于公开了β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白在提高苷类中药生物利用度方面的应用，特别是将橙皮苷转化为苷元药物方面的应用。

为实现上述目的本发明提供如下的技术方案：

一种编码β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶的基因，该基因具有SEQ ID NO：1。

本发明所述的β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶，它具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

本发明所述β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶的重组表达质粒的载体为pQE30-Xa-bglA。

本发明进一步公开了β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶在制备提高苷类化合物生物利用度药物方面的应用。特别是β-葡萄糖苷酶同工酶BglA蛋白酶在制备提高陈皮中橙皮苷的生物利用度药物方面的应用。

实验结果表明：本发明的β-葡萄糖苷酶同工酶BglA是一种新型的酶，这种酶不但耐高温，而且热稳定性优良，特别是在体外水解橙皮苷，将橙皮苷转化为苷元药物方面具有明显的作用。从而完成了本发明的工作。

本发明首先公开了橙皮苷的提取及BglA蛋白体外水解橙皮苷的方法：

橙皮苷提取自陈皮，采用超声提取方法。4g陈皮被粉碎为粒径大小为1mm粉末，200ml甲醇溶解，40℃，60mHz超声60min，重复一次。将甲醇超声提取液过滤后蒸发干燥，残留物溶解于含5％(v/v)丙二醇的水中，终浓度为10mg/ml。所得溶液用0.1ml，0.01M草酸酸化，HPLC定量。然后将本研究克隆S.singularis的bglA基因，将之与表达载体pQE30-Xa相连接组成重组质粒pQE-30Xa-bglA，并成功在E.coli中表达。