[发明专利]中药贝母提取物中贝母素甲和贝母素乙的检测方法

权利要求书

1.中药贝母提取物中贝母素甲和贝母素乙的检测方法，其特征在于步骤和条件如下：

1.1待检品的制备

1.1.1中药贝母

1.1.2贝母素甲标准溶液和贝母素乙标准溶液的制备

分别把贝母素甲标准品和贝母素乙标准品溶解甲醇中，制得贝母素甲标准品储备液和贝母素乙标准品储备液，所述的储备液的浓度为分别为5.0mmol/L，储备液在4℃冰箱中冷藏保存；

分别用甲醇，将贝母素甲标准品储备液和贝母素乙标准品储备液稀释成浓度为5.0×10^-4mol/L的贝母素甲标准溶液和贝母素乙标准溶液；

1.1.3贝母提取物相关溶液的制备

A.贝母提取物溶液的制备

将贝母研磨成粉末，过40目筛子，称取0.2g中药贝母粉末，用0.2mL氨水碱化，然后在超声池中用3.0mL氯仿超声萃取30min，萃取操作重复2次，合并萃取液，在室温下挥发掉氯仿，得到中药贝母提取物干物质；由0.2g中药贝母粉末提取的干物质溶解在1.0mL甲醇中，用0.45μm的滤膜过滤，得到贝母提取物溶液；

B.贝母提取物稀释溶液的制备

由步骤A得到的贝母提取物溶液用甲醇稀释，获得贝母提 取物稀释溶液，甲醇加入的体积是步骤A甲醇体积的20或120倍；

C.贝母提取物稀释加标溶液的制备

向步骤A得到的贝母提取物溶液中分别加入由步骤1.1.2获得的浓度为5.0×10^-4mol/L的贝母素甲标准溶液和浓度为5.0×10^-4mol/L的贝母素乙标准溶液，用甲醇稀释获得贝母提取物稀释加标溶液，甲醇加入的体积是步骤A甲醇体积的20或120倍；

1.2检测步骤和条件

1.2.1仪器装置

内径50μm未涂层融硅毛细管；直径500μm铂盘工作电极；±30kV直流高压电源，美国Spellman高压电子公司生产；电化学发光检测系统，西安瑞迈分析仪器有限责任公司生产；CHI 832型电化学分析仪，上海辰华仪器公司生产；

1.2.2试剂

NaH₂PO₄，Na₂HPO₄，NaOH，氨水，氯仿，甲醇，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(BMImBF₄)，三联吡啶钌的六水合氯化物(Ru(bpy)₃²⁺)，贝母素甲和贝母素乙的标准品，二次水；所用试剂均为分析纯；配制好的溶液在使用之前均经0.45μm滤膜过滤；

1.2.3溶液的制备

1.2.3.1背景电解质溶液的配制

(1)磷酸盐缓冲溶液的配制 

配制浓度为200.0mmol/L的NaH₂PO₄和浓度为200.0mmol/L的Na₂HPO₄，将同浓度的二者混合再用二次水稀释配成浓度为100.0mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，调整磷酸盐缓冲溶液pH值为7.48；

(2)Ru(bpy)₃²⁺溶液的配制

用二次水配制20.0mmol/L Ru(bpy)₃²⁺溶液；

(3)背景电解质溶液的配制

将步骤(1)制备的磷酸盐缓冲溶液与步骤(2)制备的Ru(bpy)₃²⁺溶液混合，用二次水稀释配制背景电解质溶液；背景电解质溶液中磷酸盐浓度为50.0mmol/L，Ru(bpy)₃²⁺浓度为5.0mmol/L；

(4)含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝母素乙的背景电解质溶液的配制

先将步骤(1)制备的磷酸盐缓冲溶液与步骤(2)制备的Ru(bpy)₃²⁺溶液混合；把得到的混合溶液中的一部分加入由步骤1.1.2获得的贝母素甲标准溶液，把得到的混合溶液中的另一部分加入由步骤1.1.2获得的贝母素乙标准溶液，然后分别用二次水稀释，分别得到含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝母素乙的背景电解质溶液；含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝母素乙的背景电解质溶液中磷酸盐浓度均为50.0mmol/L，Ru(bpy)₃²⁺浓度均为5.0mmol/L，贝母素甲和贝母素乙的浓度均为1.0×10^-6mol/L； 

1.2.3.2运行缓冲溶液的配制

(a)磷酸盐缓冲溶液的配制

配制浓度为200.0mmol/L的NaH₂PO₄和浓度为200.0mmol/L的Na₂HPO₄，将同浓度的二者混合，再用二次水稀释配成浓度为100.0mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，调整磷酸盐缓冲溶液pH值为8.00；

(b)BMImBF₄溶液的配制

将BMImBF₄用二次水稀释配成浓度为100.0mmol/L的溶液；

(c)运行缓冲溶液的配制

将步骤(a)得到的磷酸盐缓冲溶液与步骤(b)获得的BMImBF₄溶液混合，再用二次水稀释得到运行缓冲溶液；运行缓冲溶液中磷酸盐浓度为8.0mmol/L，BMImBF₄浓度为40.0mmol/L；

1.2.4检测步骤

1.2.4.1分离毛细管的处理

为了保证贝母素甲和贝母素乙高效分离，灵敏检测及分析结果的重现性，需对毛细管做以下处理：

新的毛细管柱使用0.1mol/L氢氧化钠活化过夜，之前，毛细管柱用0.1mol/L浓度的氢氧化钠冲洗5min，再用二次水冲洗5min，然后用由步骤1.2.3.2获得的运行缓冲溶液平衡5min；

由于中药贝母提取物中含有大量共存物质对毛细管内壁产 生吸附，因此，在两次进样之间需要对毛细管进行如下活化处理：毛细管柱用0.1mol/L浓度的氢氧化钠冲洗30s，再用二次水冲洗30s，然后用由步骤1.2.3.2获得的运行缓冲溶液平衡30s。1.2.4.2贝母素甲标准品溶液和贝母素乙标准品溶液的循环伏安实验

在步骤1.2.3.1(3)获得的背景电解质溶液中循环扫描3-10周，扫描电位区间是0-1.30V，记录稳定时的循环伏安曲线；然后分别用由步骤1.2.3.1(4)获得的含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝母素乙的背景电解质溶液中循环扫描3-10周，扫描区间同样为0-1.30V，记录稳定时的循环伏安曲线；

将由含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝母素乙的背景电解质溶液获得的循环伏安曲线分别与背景电解质溶液得到的循环伏安曲线进行比较，以确定贝母素甲和贝母素乙具有电化学活性及其电化学活性区间；

1.2.4.3中药贝母提取物的检测

将步骤1.1.3中的步骤B得到的贝母提取物稀释溶液和1.1.3中的步骤C得到的贝母提取物的稀释加标溶液分别按下述条件进行检测：

检测电位1.20V；进样时间3s；进样高压16kV；电泳分离高压16kV；检测池中添加步骤1.2.3.1制备的背景电解质溶液；电泳采用步骤1.2.3.2获得的运行缓冲溶液；三电极体系包括直径500μm铂盘工作电极、铂丝对极以及Ag/AgCl参比电极；毛细管柱内径50μm；电化学发光采用柱端检测模式；光电倍增管偏置电压设定在800V；获得中药贝母检测的电泳图谱。