[发明专利]具有杀虫增效作用的棉铃虫钙粘蛋白基因片段hacad1及应用

说明书

技术领域

本发明属农业微生物学应用技术领域。具体涉及一个具有杀虫增效作用的棉铃虫钙粘蛋白基因片段的分离、克隆以及它编码的多肽片段在微生物杀虫剂中的应用。本发明与微生物基因工程和微生物农药技术领域有关。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种广泛存在于各种生态环境中的革兰氏阳性杆状细菌。该物种最大的特点就是在其生长周期中能形成内生芽胞的休眠体，并且在其芽胞形成的同时能产生对许多昆虫具有特异毒性的由杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)组成的伴胞晶体。这些杀虫晶体蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆虫纲10个目500多种昆虫以及原生动物、线形动物门、扁形动物门中某些有害种类也有特异的生物活性(Schnepf H E，Crickmore N，Rie J V，Lereclus D，BaumJ，Feitelson J，Zeigler D R，Dean D H.1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.MicrobiolMol Biol Rev，62：775-806)。由于苏云金芽胞杆菌对多种昆虫都有很高的杀虫活性，而且具有对环境和人蓄无损害等优点，因此被广泛地应用于生物农药的开发。目前，基于苏云金芽胞杆菌开发的生物杀虫剂已经成为最成功的一种生物农药，占到了整个生物农药行业90％以上的市场，广泛地应用于农业、林业和仓储等害虫的防治。同时人们也不断将苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白基因转入植物中，构建转基因植物，用于农业害虫的防治(Pigott CR and Ellar DJ.2007.Role of receptors in Bacillus thuringiensis crystal toxinactivity.Microbiol Mol Biol Rev 71：255-281.)。

随着Bt杀虫剂和Bt转基因植物的不断推广和使用强度的不断增加，目标害虫对Bt产品的抗性现象也不断被科学家所发现(Bravo A，Soberón M.2008.How to cope with insect resistance to Bt toxins？TrendsBiotechnol.26(10)：573-579.)。抗性问题的存在严重制约了Bt杀虫剂和Bt转基因植物产品的应用和推广，威胁着整个行业的快速发展。解决这一问题的有效途之一就是寻找新的杀虫增效因子，用以显著提高杀虫晶体蛋白的杀虫活性，并延缓或克服昆虫对Bt产品产生的抗性。Hilder等利用丝氨酸蛋白酶抑制剂使苏云金芽胞杆菌产生的杀虫晶体蛋白的杀虫活性提高20倍以上(Hilder VA，Gatehouse AMR，Sheerman SE，Barrer RF，Boulter D.1987.A novel 4 mechanism of insect resistance engineered into tobacco.Nature330：160-163.)；Regev等发现几丁质酶(Chitinase)可以通过降解昆虫围食膜的几丁质层而大幅提高Bt杀虫晶体蛋白的杀虫活性(Regev A，Keller M，Strizhov N.1996.Synergistic activity of a Bacillus thuringiensisdelta-endotoxin and a bacterial endochitinase against Spodoptera littoralis larvae.Appl Environ Microbiol62：3581-3586.)。此后，越来越多的协同增效因子被发现，如双效菌素Zwittermicin A，伴侣蛋白P20，溶细菌毒素Cyt等(Pardo-L′opez L，Mu~noz-Garay C，Porta H，Rodr′1guez-Almaz′an C，Sober′on M，Bravo A.2008.Strategies to improve the insecticidal activity of Cry toxins from Bacillus thuringiensis.Peptides.Epubahead of print)。最近，Mohan等又发现植物半胱氨酸蛋白酶在昆虫取食以后，能够作用于昆虫中肠的围食膜，通过提高围食膜的通透性来毒杀毛虫，同时可以大幅提高Bt杀虫晶体蛋白的杀虫活性。并且这种作用可以广泛应用于多种杀虫晶体蛋白活性的提高和多种昆虫的生物防治当中(Mohan S，Ma PW，Williams WP，Luthe DS.2008.A naturally occurring plant cysteine protease possesses remarkable toxicity against insect pestsand synergizes Bacillus thuringiensis toxin.PLoS ONE 3(3)：1786.)。这些研究结果为Bt杀虫晶体蛋白的杀虫活性的提高和害虫抗性治理等方面提供了非常有效的策略。