[发明专利]日本血吸虫MF3蛋白基因、其编码蛋白及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种日本血吸虫蛋白，特别是涉及一种日本血吸虫MF3蛋白基因、其编码蛋白及应用。

背景技术

血吸虫病由血吸虫的感染引起，在世界上有76个国家，受感染者约1.5亿。致病的血吸虫有3种，既日本血吸虫(Schistosoma japonicum)，曼氏血吸虫(S.mansoni)和埃及血吸虫(S.haematobium)。在我国流行的是日本血吸虫。血吸虫病的流行给人民身体健康和经济发展都造成巨大的损失，因此，防治血吸虫病、开发研制血吸虫临床诊断试剂和抗血吸虫的药物具有巨大的社会和经济效益。

日本血吸虫作为寄生虫能在人体和动物体内存在很多年而不被宿主的免疫机制杀死，与它的免疫逃避能力有关。其免疫逃避机制有抗原模拟、抗原伪装和免疫调节。其中免疫调节指的是血吸虫的蛋白能够调节、干扰(主要是抑制)宿主的免疫系统，使其不能发挥正常的免疫攻击效能，从而有利于血吸虫的生存。

血吸虫的排泄/分泌抗原(Excretory/Secretory protein，ESP)就是一类可以发挥免疫调节作用的蛋白质。这些蛋白来自血吸虫的表皮和肠道上皮，或者是特化的排泄/分泌器官。血吸虫各个虫期都产生这类蛋白。ESP是潜在药物靶点和疫苗分子，因为抑制这些蛋白可以干扰血吸虫的免疫逃避机制从而增强宿主的免疫杀灭功能；ESP是潜在的诊断分子，因为这些蛋白游离于宿主的血液中，可以很方便地用现有手段检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种日本血吸虫MF3蛋白基因、其编码蛋白及应用，该蛋白能成为很好的诊断标记分子。

为解决上述技术问题，本发明的日本血吸虫MF3蛋白的基因，包括：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

所述的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.2所示序列的蛋白。

本发明的日本血吸虫MF3蛋白，包括：

具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白，该蛋白是具有SEQ ID NO.1序列编码的蛋白。

利用蛋白质组学手段，通过直接分析感染动物(兔子)的血液，发现日本血吸虫的MF3蛋白(Accession number：AY809998.1)在宿主血液中也存在，是其ESP的成分之一，表明该蛋白可能在血吸虫的免疫调节、免疫逃避方面发挥重要作用；这也使它成为很好的诊断标记分子。这是国际上首次发现MF3蛋白出现在日本血吸虫的ESP中。

本发明的日本血吸虫MF3蛋白作为免疫原，在制备血吸虫疫苗方面的应用；作为潜在的药物作用靶点，在筛选化学和其他种类药物方面的应用；作为特异性血吸虫抗原，在制备抗血吸虫抗体方面的应用；在血清学诊断方面的应用；日本血吸虫MF3蛋白的编码基因，在基因治疗方面的应用。

具体实施方式

一、方法

1、感染动物，制备感染血清

在血吸虫流行区中收集自然感染的阳性湖北钉螺(Oncomelania hupensis hupensis)，将钉螺浸入水中，加以光照，收集浮在水面上的尾蚴。新西兰大白兔剃去腹部的毛，露出皮肤；取日本血吸虫1000条尾蚴，经裸露的兔子皮肤感染兔子。收集感染后第42天的动物血液，制备血清。

2、感染动物血清蛋白的提取

用6倍体积的冷丙酮加入到血清中，沉淀血清中的蛋白，离心收集蛋白沉淀(5000rpm，5分钟)，溶解沉淀用50mM Tris-HCl(pH 8.3)，5mM EDTA，1mM phenylmethyl sulfonylfluoride(PMSF)，0.5％ sodium dodecyl sulfate(SDS)，0.5mM二硫苏糖醇(DTT)，0.5％SDS，利用超声波促进蛋白溶解。

3、血清蛋白的酶解过程

血清蛋白混合物加入终浓度10mM DTT，室温反应30分钟，再加入终浓度55mM的碘乙酰氨置暗处反应15分钟，用去离子水稀释5-10倍，按1∶50的体积比例加入修饰的测序级牛胰酶，37℃酶解过夜。

4、血清蛋白酶解肽段混合物用强阳离子交换柱(Strong Cation Exchange，SCX)进行分级

SCX柱的平衡和清洁：SCX柱在每次使用前，先用高盐溶液(500mM/25％ ACN，pH 3.0)过柱，然后用(H₂O/25％ACN，pH 3.0)平衡。清洗柱则用高盐溶液。