[发明专利]一种解除铵阻遏的生物产氢基因工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，更具体地，本发明涉及一种可以在高铵(铵离子)浓度下进行高效光合制氢的基因工程菌株及其构建方法。

背景技术

作为一种清洁能源载体，生物法制氢有着广阔的发展前景。在各种生物法制氢的方式中，应用紫色非硫细菌(purple non-sulfur bacteria)如类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)进行光发酵制氢具有明显的优势。首先，紫色非硫细菌可以利用多种小分子有机物制氢，甚至包括暗发酵无法降解的乙酸，因此可以在制氢的同时处理发酵废水。其次，紫色非硫细菌可以彻底降解有机物到二氧化碳，因此利用同样的底物，它的理论产氢量大大高于暗发酵制氢。另外，利用光发酵产生的氢气纯度(75％-90％)比暗发酵的纯度(40％-60％)高很多，这使得随后的纯化更容易。还有，这种制氢方式可以直接利用太阳能，而且不需要复杂的半导体太阳能板。以上的优势使光发酵制氢成为应对化石能源危机和日益增长的有机废物的可行方案之一。但光发酵制氢用于生产仍有一些问题有待解决。其中之一，就是如何解除铵对制氢的抑制。

紫色非硫细菌在光照下通过固氮酶催化产生氢气。由于固氮酶的表达和活性会受到铵的严格控制，因此在有丰富氮源时无法产生氢气。许多报道指出，在添加铵2-3分钟后紫色非硫细菌的固氮酶就会被完全抑制，这种抑制完全解除需要将氮源消耗殆尽，往往是一个相当长的过程。有报道称游离铵离子浓度达到14mM时类球红细菌就会完全丧失产氢能力。在光发酵制氢的研究中，为了避免铵阻遏现象，通常使用谷氨酸作为制氢培养基的氮源。然而许多废水中铵离子的浓度超过14mM。例如，味精厂废水中铵离子的浓度为55-533mM，焦化废水为200mM，化肥厂废水中铵离子的浓度高达897mM。高浓度的铵离子会抑制紫色非硫细菌利用这些废水中的有机物产氢。

为了解决光发酵制氢过程的铵阻遏，已有很多科学家作过尝试。他们采用与其他厌氧微生物共培养或者两步法先将培养基中的铵消耗掉然后进行制氢。例如，在含有2.1mM铵的豆腐废水中，类球红细菌与厌氧菌clostridiumbutyricum IFO 3847共培养可以产生2.2mL氢气/mL废水，而单独使用类球红细菌时产氢量为1.9mL/mL废水。Takabatake等人发现紫色非硫细菌经过96小时的生长后会消耗掉培养基中18mM的铵离子，然后开始产生氢气。但在以上这些尝试中，铵抑制解除效果并不十分明显。

随着对铵抑制机理的了解，科学家希望通过遗传操作来获得可以解除铵抑制的突变体。nifA基因编码nif基因的特异性转录激活因子，它控制着固氮酶的合成。许多解除铵阻遏的遗传改造与nifA的转录和活性有关。一株组成型过表达nifA的荚膜红细菌突变体可以在15mM铵离子浓度下介导nif基因的转录。NtrB/NtrC在荚膜红细菌中被证实是全局性调控nif基因的双组分系统，PII蛋白介导该系统的激活。氮源缺乏条件下NtrB将调控因子NtrC磷酸化进而激活。相反，铵存在时，PII蛋白会介导NtrC的去磷酸化最终使nifA的转录终止。荚膜红细菌的PII蛋白突变体在20mM铵离子浓度下保持高水平的产氢活力。突变株的固氮酶活是野生型的4倍，产氢也有1.5倍的增强。但同样的类球红细菌PII蛋白突变体在2mM铵离子浓度下只能产生野生型无铵条件氢气量的1/6，还没有试验结果证实PII蛋白和NtrB/NtrC系统在类球红细菌或其他光合细菌中也参与nif基因表达的全局性调控。因此，这些光合细菌需要更有效的方法解除铵阻遏。

综上，本领域还有必要开发可彻底地解除铵阻遏的细菌，以高产地获得氢能源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种解除铵阻遏的生物产氢基因工程菌及其构建方法和应用。

在本发明的第一方面，提供一种解除铵阻遏的生物产氢基因工程菌，其不表达谷氨酰胺合成酶(GS)。

在一个优选例中，通过基因敲除的方法使所述的基因工程菌不表达谷氨酰胺合成酶。

在另一优选例中，所述的基因工程菌的基因组中，含有突变的glnA基因序列，其不编码谷氨酰胺合成酶(即不表达谷氨酰胺合成酶)。

在另一优选例中，所述的突变的glnA基因序列为：内部插入了卡那霉素抗性基因序列的glnA基因序列。

在另一优选例中，所述的卡那霉素抗性基因序列插入在glnA基因序列的内部的stuI位点上。

在另一优选例中，所述的突变的glnA基因序列为：内部插入了氯霉素抗性基因或链霉素抗性基因序列glnA的基因序列。