[发明专利]一种组织培养快繁细叶小羽藓配子体的方法

说明书

技术领域

本发明是涉及一种组织培养快繁细叶小羽藓配子体的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

细叶小羽藓(Haplocladium microphyllum(Hedw.)Broth.)隶属羽藓科(Thuidiaceae)的小羽藓属(Haplocladium)苔藓植物。植物体体形中等，黄绿色或绿色，老时呈黄褐色，常交织成片；茎匍匐，长可达5cm以上，规则羽状分枝，中轴分化；鳞毛披针形至线形，密生茎上，而枝上稀少或缺失；茎叶干燥时疏松贴生，由阔卵形基部渐上成细长尖，长可达1.2mm；茎叶叶边平展，或部分背卷，具齿，中肋一般贯顶或终止于叶尖下；枝叶阔卵形，具短披针形尖，中肋不及顶，或略突出于叶尖；蒴柄细长，可达2cm以上，红棕色，平滑，孢蒴弓形弯曲，长约2mm。丘林地区以腐木着生为多，其次为土生及石生。

很多研究结果表明：细叶小羽藓(H.microphyllum)的匍匐羽状分枝结构对大气环境污染的变化十分敏感，其对Cu、Pb、Zn、Cr、Cd五种重金属的富集能力(应用生态学报，2006，17(8)：1490～1494)几乎是常见几种杂草如小飞蓬、龙葵、加拿大一枝黄花等植物茎叶体的3～10倍(上海交通大学学报：农业科学版，2002，20(1)：22～29)，利用它作为指示大气重金属污染具有明显优势。因此，建立细叶小羽藓快繁系统，对研究大气重金属元素在苔藓植物体内的迁移、分布和富集机制具有重要意义。但现有技术中还没有在试管内大量扩繁羽藓属植物配子体的相关培养技术报道，更没有将细叶小羽藓组织培养成配子体的相关技术报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种组织培养快繁细叶小羽藓配子体的方法，以填补现有技术的空白，实现人工大量快速扩繁细叶小羽藓，为研究苔藓植物对大气重金属污染的生理响应和重金属元素在苔藓植物体内的迁移、分布和富集机制提供便捷。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供的组织培养快繁细叶小羽藓配子体的方法，包括如下顺序步骤：

a)切取细叶小羽藓配子体新生羽状分枝先端，进行表面灭菌，然后接种到改良Knop′s培养基上，进行培养10天，培养条件为：温度25±2℃，光照强度2000lx，光照时间10小时/天；所述改良Knop′s培养基配方为：改良Knop′s基本培养基+0～10g/l蔗糖；

b)将步骤a)得到的无菌外植体转接到诱导新生配子体产生的培养基上，进行培养50天，培养条件为：温度(20～35)±2℃，光照强度3000lx，光照时间12小时/天；所述诱导新生配子体产生的培养基配方为：改良Knop′s基本培养基+0.1～2.0mg/l 6-苄氨基嘌呤+0.01～0.2mg/l萘乙酸+10g/l蔗糖；

c)将步骤b)诱导培养得到的新生配子体切割剪碎，接种到配子体增殖扩繁的培养基上，进行培养50天，培养条件为：温度(20～35)±2℃，光照强度3000lx，光照时间12小时/天；所述配子体增殖扩繁的培养基配方为：改良Knop′s基本培养基+0～0.5mg/l 6-苄氨基嘌呤+0.05mg/l萘乙酸+10g/l蔗糖；

所述改良Knop′s基本培养基的配方为：KNO₃ 250mg/l、MgSO₄·7H₂O250mg/l、KH₂PO₄ 250mg/l、Ca(NO₃)₂·4H₂O 1000mg/l、酒石酸氨0.115mg/l、NaFe-EDTA 36.7mg/l、MnSO₄·4H₂O 11.15mg/l、H₃BO₃ 3.1mg/l、KI 0.415mg/l、ZnSO₄·7H₂O 4.3mg/l、CuSO₄·5H₂O 0.0125mg/l、NaMoO₄·2H₂O 0.125mg/l、CoCl₂·6H₂O 0.0125mg/l。

步骤a)中切取的细叶小羽藓配子体新生羽状分枝先端的长度优选0.3mm。

步骤a)中对细叶小羽藓配子体新生羽状分枝先端表面的灭菌条件优选如下：先用75％的酒精溶液灭菌20秒，再用0.1％的升汞溶液灭菌2分钟。