[发明专利]一种实时荧光RT-PCR检测猪流感病毒的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种实时荧光RT-PCR检测猪流感病毒的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术早期、快速诊断猪流感病毒感染的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对呼吸道样本、血清、肺组织等样品中的猪流感病毒进行早期快速诊断。

背景技术

猪流感(SI)是一种因猪流感病毒引起的猪呼吸系统疾病，此病在世界各地都有发生，危害严重，经济损失巨大，并对人类的健康构成威胁。猪流感病毒(SIV)属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，甲型流感病毒属(Influenza virus A)。典型病毒颗粒呈球状，直径为80nm～120nm，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是血凝素HA、神经氨酸酶NA和M2蛋白。病毒颗粒内为核衣壳，呈螺旋状对称，直径为10nm，它含核蛋白(neucleoprotein，NP)，3种多聚酶蛋白(polymerase protein 1，PB1；polymerase protein 2，PB2；polymerase protein A)和病毒单链RNA。猪流感病毒为单股负链RNA病毒，基因组约为13.6kb，由大小不等的8个独立片段组成。猪流感病毒能够在多种动物的细胞和鸡胚增殖。病毒具有血凝活性，但不同毒株的抗原性无明显的区分。由于病毒受到抗体的压力很大，因此病毒的变异频繁。尽管不同亚型之间可以组成很多种流感病毒血清型，但从猪身上分离到四种主要的亚型：H1N1、H1N2、H3N2和H3N1，其中有三种亚型造成人感染，分别为：H1N1、H1N2和H3N2。

猪流感病毒在猪群中全年可以传播，但多数暴发于秋季末期和冬季，具有高发病率(几乎100％)和低病死率(病死率≤1％)的特点。猪流感病毒感染可使患病猪生产性能下降，推迟上市；还可引起呼吸道细菌和病毒继发或混合感染，使疫情更为严重，造成猪只死亡。猪是人源、禽源和猪源流感病毒的惟一共同易感宿主，因此猪在禽-猪-人的流感种间传播过程中，起着中间宿主及多重宿主的作用，它能将猪流感病毒传播给人或鸟类。美国曾于1976年在新泽西州迪克斯堡的士兵中出现猪流感爆发，引起200多例病例，其中至少4名士兵进展成肺炎，1人死亡，该病毒与当时从猪体内分离的病毒相同，首次证实了在自然条件下，猪流感病毒可从猪传播给人。1988年，美国出现了猪流感人际间传播的迹象，接触过一例猪流感病例的医护人员中出现了轻微的流感样疾病，并在血清中检测出猪流感抗体。2005年12月至2009年2月期间，美国共报道了12例人感染猪流感病例，但均未出现死亡。1999年10月，香港1名10月龄女婴感染了猪流感病毒H3N2，现已完全康复。这些年来，世界各地都有人感染猪流感病毒不同病毒株的报道，但并没有大规模流行。2009年3月，墨西哥及美国等部分地区暴发了人感染猪流感疫情，即甲型H1N1流感病毒感染，可以人传染人，可能出现全球性爆发流行的潜在危险。

人感染猪流感的潜伏期尚不明确，参照流感的潜伏期一般为1-3天。临床症状与流感相似，包括发热、咳嗽、咽痛、躯体疼痛、头痛、畏寒和疲劳等。有些人还会出现腹泻和呕吐，甚至引起严重疾病(肺炎和呼吸衰竭)和死亡。人感染猪流感病毒后，现有资料表明，传染期为发病前1天至发病后7天。若病例发病7天后仍有发热症状，表示仍具有传染性。儿童，尤其是幼儿，传染期可能长于7天。

猪作为流感病毒的“混合器”，在流感病毒跨种属障碍而感染新宿主的过程中起着重要的作用。由于猪上皮细胞具有唾液酸2，6-半乳糖苷和唾液酸2，3-半乳糖苷，人流感病毒可与前者结合，而禽流感病毒与后者结合，因此，猪上皮细胞就能够被人流感病毒和禽流感病毒感染，而成为毒株间基因重组的活载体。1998年从美国北卡罗来纳州分离到一株H3N2亚型SIV，其HA，NA和PB1基因为人型流感病毒基因，M，NP和NS基因为猪型流感病毒基因，PB2、PA基因为禽型流感病毒基因。1978年，日本暴发的H1N2SIV是由H1N1和H3N2基因重组而产生的新亚型。国内从山东猪分离出H9N2流感病毒，分析可能是由鸡和鸭流感病毒重组的结果。继H9N2亚型流感病毒1998年首次从猪群中分离到，研究表明，通过进行部分序列分析发现，猪源H9N2亚型与国内分离的禽流感病毒高度同源。SI和人流感之间也可以发生交叉感染和传播。1978年，从台湾的一个猪群中分离到了H3N2亚型SIV，通过测序发现，此病毒发生了人流感病毒和SI病毒基因片段的重组。2009年墨西哥和美国出现的甲型H1N1流感病毒，被认为该毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片断。