[发明专利]一种检测重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗的制造与检验，具体涉及一种检测重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法。

背景技术

近年来，重组鸡痘病毒活疫苗研制已成为疫苗研制的热点，许多国家已有产品获准生产。在我国禽流感重组鸡痘病毒活疫苗已上市，还有多个产品处于临床试验阶段。常用的鸡痘病毒活疫苗空斑形成单位(PFU)计数方法多以琼脂覆盖法或显微镜下直接计数法进行。琼脂覆盖法操作繁琐，影响因素多，空斑出现迟；显微镜下直接计数时常常因为空斑不典型，特别是孔板或培养瓶边缘的空斑难以确认，或有细胞团块干扰，造成计数不准确。因此，在重组鸡痘病毒活疫苗制造和检验中，迫切需要一种简易、快速、准确的检测疫苗病毒PFU的方法。

技术内容

为了克服现有重组鸡痘病毒活疫苗空斑计数方法操作繁琐、计数不准确的不足，本发明提供一种重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法，有效地解决了问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法，是将重组鸡痘病毒活疫苗10倍系列稀释，接种24孔培养板培养的次代CEF，每个稀释度接种3孔，72h终止培养，吸去培养液，加2mL/L戊二醛固定液固定15min，吸去固定液，加500ug/ml X-gal染色液染色，37℃培养箱过夜(或8-12小时)。取出培养板放倒置显微镜下计数蓝染的空斑，计算疫苗病毒含量(PFU)。

由于近几年研制的重组鸡痘病毒活疫苗，插入的筛选标记基因一般都选择LacZ基因(表达β-半乳糖苷酶)，本研究利用重组鸡痘病毒携带LacZ标记基因特点，建立了用X-gal直接进行病毒空斑染色计数PFU的方法。本方法可适用于所有选择LacZ基因作为标记基因的重组鸡痘病毒活疫苗的PFU检测。

X-gal染色原理是X-gal被重组鸡痘病毒表达的β-半乳糖苷酶裂解成半乳糖和5-溴-4-氯-3-羟基吲哚，5-溴-4-氯-3-羟基吲哚然后被氧化成5，5’-二溴-4，4’-二氯-靛蓝(蓝色产物)。

本发明的有益效果是，X-gal染色计数法，细胞培养终止时间为72h，而常规的琼脂覆盖法计数空斑要5～6天。染色计数法计数时，培养板边缘空斑染色清楚，染色的蓝色空斑与背景对比清晰，识别容易，使得PFU计数快速而准确。

附图说明

图1是X-gal染色的rFPV-11SH5A空斑(100×)

A.接种72h，染色的空斑。

B.位于孔板边缘的染色空斑。

C.接种48h，空斑染色细胞少

图2是两种PFU计数方法的计数结果

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

重组鸡痘活疫苗(rFPV-11SH5A)：(陈素娟，孙蕾，石火英，彭大新，刘秀梵；《禽流感病毒H5亚型主要保护性抗原在禽痘病毒中的高效表达》中国兽医学报，2007，27(2)：200-2002)

实施例1.表达禽流感HA基因重组鸡痘活疫苗(rFPV-11SH5A)的检测。取实验室制备的8批次rFPV-11SH5A疫苗细胞苗，分别进行染色计数法计数和直接计数法计数。

染色计数法计数：rFPV-11SH5A疫苗细胞苗10倍系列稀释，各取100ul 10^-4～10^-6稀释度的病毒，接种到24孔培养板培养的次代鸡胚成纤维细胞(CEF)上，每个稀释度接种3孔，吸附2h，加维持液，37℃CO2培养箱，72h终止培养，吸去培养液，加2mL/L戊二醛固定液固定15min，吸去固定液，加500ug/ml X-gal染色液染色，37℃培养箱过夜(或8-12小时)。取出培养板放倒置显微镜下计数蓝染的空斑。培养板边缘空斑染色清楚，染色的蓝色空斑与背景对比清晰，识别容易，见图1。

染色计数法计数的PFU数是直接计数法的1.6-3.3倍，见图2。