[发明专利]一种食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。涉及一种食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法，该方法适用于以PCR法、定量PCR法、实时PCR法检测，快速提取食品中致病菌。

背景技术

俗话说民以食为天，可见食品与人类生存和健康密切相关。为保证食品的安全卫生、防止有毒有害物质通过食品对人体造成危害是至关重要的。

食品在生产、加工、贮存、运输和销售等各个环节都有受到环境中各种因素的影响和污染的可能，微生物污染尤其常见。

食品中致病菌主要是指以食物为载体，导致人类发生疾病的一大类细菌。(吴清平，范宏英，张菊梅.食源性致病菌免疫及分子检测新技术研究进展[J].食品科学，2005，26(11)：269-273.)包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureu5)、沙门氏菌(Salmonella spp)、志贺氏菌(Shigellaspp)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria Monocytogenes)、肠出血性大肠埃希氏菌O157：H7(Enterohemorrhagic escherichia coli O157：H7)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)(食品中致病菌检测方法实时PCR法》行业标准[SN/T 1870-2007])。食品由于受致病菌污染，造成各种食源性疾病，甚至死亡。

在我国食品行业，相关的致病菌检测的传统检验方法有：培养基制备、细菌培养、菌落计数和生化指标的检测。这些方法的优点是：直观且能够得到食品样品中细菌数量和特性等方面的定性及定量结果。不足之处是：耗时费力，获得结果通常需要几天的时间，并且要求所要检测的细菌增殖为可见菌落。而且增加了实验室的工作量。(焦振泉，郭云昌，裴晓燕，刘秀梅.食源性致病菌检测方法研究进展—I.传统检测方法[M].中国食品卫生杂志，2007，19(1)：58-61.)

近年来，DNA杂交、PCR、定量PCR、实时PCR以及基因芯片法(焦振泉，郭云昌，裴晓燕，刘秀梅.食源性致病菌检测方法研究进展—II.分子生物学检测方法[M].中国食品卫生杂志，2007，19(2)：153-157.)等分子生物学的检测方法，克服了传统检测方法的不足，并且具有各自的优势，其中以实时PCR更为便捷和快速。PCR、定量PCR、实时PCR比DNA杂交需要更少的样本量，灵敏度更高；基因芯片法虽然可以同时鉴定多种细菌的混合污染，但是背景干扰比较大、使用两种染料与DNA标记时效果不同、从不同细菌中分离出来的RNA的完整性不同、实验费用高以及结果分析方法的不一致；实时PCR比PCR、定量PCR，具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高的优势。

目前，也有使用免疫磁珠提取某种特定细菌的方法再通过实时PCR法结合检测食品中致病菌，虽然此方法特异性高，检测速度快。但是成本较高，通用性差，而且只能针对一种特定菌种进行富集。

我国质量监督检验总局于2007年批准了《食品中致病菌检测方法实时PCR法》行业标准[SN/T 1870-2007]。实时PCR法由于具有高灵敏度，操作简便易学，结果可靠的优点，解决了传统方法费时耗力以及其他分子生物学检测方法易污染，背景干扰大等无法避免的缺点，现已被食品行业广泛使用。

按照[SN/T 1870-2007]标准规定，模板提取步骤包括：样品制备、增菌培养和分离；模板DNA制备等必不可少两部分，其中：

样品制备、增菌培养和分离步骤：需要先称取样品1g加入125ml样品稀释瓶中，再加入9倍预热到45℃灭菌水(1∶10稀释)，37℃培养18h-22h。再移取培养18h-22h的悬液各10ml加入90ml增菌肉汤中，37℃培养18h-22h。此处37℃，18h-22h的两次培养过程不可逾越，也是限制食品工业当天的生产无法出售的重要原因。

模板DNA制备步骤：需将制备样品的肉汤取1ml加到1.5ml无菌离心管中，8000r/min离心5min，弃上清液。加入50μlDNA提取液，混匀后，沸水浴5min，12000r/min离心5min，取上清待检。