[发明专利]扇贝急性病毒性坏死病毒核酸等温扩增检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种扇贝急性病毒性坏死病毒核酸等温扩增检测试剂盒，其特征是该试剂盒包括：

(1)研磨液，1管，内装SEMP采样液；

(2)核酸抽提液A，1管，内装浓度为4M的乙酸钠，pH为5.2；

(3)核酸抽提液B，1管，内装无水乙醇；

(4)核酸抽提液C，1管，内装70％的乙醇；

(5)TE缓冲液，1管，内装TE缓冲液，包括10mM Tris-HCl和1mMEDTA，且pH为8.0；

(6)LAMP反应液，1管，内装LAMP反应液，包括双蒸水、MgCl₂、dNTP、Betaine、Tris-HCl、KCl、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Triton X-100、LAMP内引物AVNV-FIP和AVNV-BIP、LAMP外引物AVNV-F3和AVNV-B3以及Bst DNA聚合酶；

(7)显色剂，1管，内装核酸染料GeneFinder^TM；

(8)阳性对照核酸，1管，内装AVNV阳性质粒DNA；

(9)研磨棒，4支；

(10)盒子；

(11)一块装于盒子中的泡沫板，其上有放置上述各小管的多个小孔。

2.如权利要求1中所述的试剂盒，其特征在于4条LAMP引物的DNA序列如下：

AVNV-FIP：

5′-GACATCTGGCGGTATTTTCAATATGTTTTTGCAGTTTAAATCTCCCAAC；

AVNV-BIP：

5′-GGTTAGATCTACAATTGCGCCATTTTCACCATTCTTTTGACACAGG；

AVNV-F3：5′-GTGCTGAGACGGAATGTG；

AVNV-B3：5′-TGGATGACACCCTTATGC。

3.一种检测扇贝急性病毒性坏死病毒的方法，其特征是使用权利要求1中所述试剂盒，按下列步骤进行：

(1)取样品扇贝的外套膜、肾或肝胰腺组织0.05～0.1g，置于离心管中，加入200μL研磨液，用研磨棒将样品充分磨碎至浆状；

(2)将研磨好的样品以5000～10000r/min离心2～5min，取100μL上清液置于新的离心管中；

(3)加入核酸抽提液A中浓度为4M的乙酸钠，上下颠倒混匀，再加入核酸抽提液B中-20℃预冷的无水乙醇并充分混合，以10000～15000r/min离心5～10min，弃上清液保留沉淀物；

(4)用核酸抽提液C中浓度为70％的乙醇洗涤上述沉淀物，然后以10000～15000r/min离心5～10min，弃上清液保留沉淀物；

(5)重复步骤(4)一次，然后将上述离心管底部的沉淀物于室温晾干，再加入50～100μL TE缓冲液溶解沉淀物，得到样品的核酸；

(6)将上述样品核酸和阳性对照核酸-AVNV阳性质粒DNA于95℃保温3～5min，立刻置于碎冰中2～5min；

(7)取上述处理后的样品核酸和阳性对照核酸分别置于新的小管中，向每个小管中加入LAMP反应液，并混匀；

(8)将上述小管于59～64℃保温45～70min，然后于80℃保温3～5min进行LAMP反应；

(9)LAMP反应结束后，向每个小管中加入GeneFinder^TM，并混匀，然后肉眼观察被测样品的LAMP反应结果，如果显示绿色则表示该样品的AVNV检测结果为阳性，如果显示橙黄色则表示该样品的AVNV检测为阴性。