[发明专利]重组人HMBOX1表达载体以及该载体表达产物及其抗体与应用

说明书

技术领域

本发明涉及重组人HMBOX1表达载体以及该载体表达产物及其抗体与应用，属基因工程技术领域。

背景技术

人HMBOX1基因是一种功能性新基因，广泛表达在人体组织中，其中在脑、胰腺、胎盘、前列腺、胸腺和睾丸组织中高表达。并且人HMBOX1基因和小鼠、大鼠、鸡、蟾蜍相比具有较高同源性，所以在遗传上具有高度保守性。人HMBOX1蛋白由421个氨基酸组成，含有和HNF(Hepatocyte Nuclear Factor)相同的功能域，提示其功能可能与HNF相关。HMBOX1是一种转录抑制因子，其与胰腺疾病具有相关性，并且与免疫杀伤功能有一定关系，但其具体机制尚不清楚。人HMBOX1抗体可以与HMBOX1特异性结合，对于研究HMBOX1在人体中的作用具有重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种重组人HMBOX1表达载体以及该载体表达产物及其抗体与应用。

一种重组人HMBOX1表达载体，通过如下步骤构建制得：

(1)从人自然杀伤(NK)细胞系NK92细胞中扩增得到人HMBOX1基因，其序列为SEQ IDNO.1所示；

(2)将步骤(1)制得的人HMBOX1基因与pGEM easy T载体(购自Promega公司)连接构建成pGEM-HMBOX1；连接方法参见pGEM easy T载体使用说明书。

(3)以步骤(2)制得的pGEM-HMBOX1为模板进行PCR扩增，设计引物时分别在5’端和3’端设计BamH I和Hind III酶切位点，得扩增产物，扩增产物序列为SEQ ID NO.2所示；

(4)将步骤(3)制得的扩增产物经BamH I和HindIII双酶切后与载体pET22b(购自Novagen公司)连接，构建得到表达产物C端带有6×Histidine标签的pET22b-HMBOX1表达基因载体，并转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，得到重组人HMBOX1表达载体。连接方法参见pET22b载体使用说明书。

上述步骤(3)中，引物序列如下：

5’端引物为5’-CGCGGATCCTATGCTTAGTTCCTTTCCAGTGGTT-3’，

3’端引物为5’-CCCAAGCTTCCAGTCATCATCCAGGGCC-3’。

上述步骤(3)中，PCR反应条件为：

95℃变性60s，58℃退火60s，72℃延伸90s，循环25次。

上述重组人HMBOX1表达载体的表达产物，具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

上述重组人HMBOX1表达载体的表达产物的制备方法，具体步骤如下：

(1)将重组HMBOX1表达载体接种到含氨苄青霉素的LB培养基中培养，培养至OD₆₀₀为0.4后，加入异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)至终浓度1mM，在30℃继续诱导培养4小时，得诱导菌液；

(2)将步骤(1)制得的诱导菌液用Ni-NTA交联的琼脂糖亲和层析进行纯化，纯化后的HMBOX1蛋白再一次进行Ni-NTA交联的琼脂糖亲和吸附，并直接在柱上呈梯度降低变性剂尿素的浓度对蛋白进行复性，最后收集复性蛋白，即为重组人HMBOX1表达载体的表达产物。

上述重组人HMBOX1表达载体的表达产物的制备方法步骤(2)中的具体步骤如下：

1)用蒸馏水浸湿空柱，弃去蒸馏水。

2)吸取2mlNTA-Resin树脂到空柱中(下端封闭)，使其自然沉积，然后拔掉下端塞子，使液体流出。

3)依次用3ml蒸馏水、5ml 1×Charge Buffer(50mMNiSO4)、3ml 1×Binding Buffer(0.5M NaCl 20mM Tris.HCl 5mM imidazol 6M尿素pH7.9)过柱子，加载Ni离子。

4)将以6M尿素溶解的包涵体蛋白通过柱子，最适流速10ml/h。

5)然后依次用5ml 1×Binding Buffer和5ml 1×Wash Buffer(0.5MNaCl 20mMTris.HCl60mM imidazol 6M尿素pH7.9)洗涤柱子。