[发明专利]重组人HMBOX1表达载体以及该载体表达产物及其抗体与应用

权利要求书

1.一种重组人HMBOX1表达载体，通过如下步骤构建制得：

(1)从人自然杀伤细胞系NK92细胞中扩增得到人HMBOX1基因，其序列为SEQ ID NO.1所示；

(2)将步骤(1)制得的人HMBOX1基因与pGEM easy T载体连接构建成pGEM-HMBOX1；

(3)以步骤(2)制得的pGEM-HMBOX1为模板进行PCR扩增，设计引物时分别在5’端和3’端设计BamH I和Hind III酶切位点，得扩增产物，扩增产物序列为SEQ ID NO.2所示；

(4)将步骤(3)制得的扩增产物经BamHI和Hind III双酶切后与载体pET22b连接，构建得到表达产物C端带有6×Histidine标签的pET22b-HMBOX1表达基因载体，并转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，得到重组人HMBOX1表达载体；

上述步骤(3)中，引物序列如下：

5’端引物为5’-CGCGGATCCTATGCTTAGTTCCTTTCCAGTGGTT-3’，

3’端引物为5’-CCCAAGCTTCCAGTCATCATCCAGGGCC-3’。

2.如权利要求1所述的重组人HMBOX1表达载体，其特征在于，上述步骤(3)中，PCR反应条件为：

95℃变性60s，58℃退火60s，72℃延伸90s，循环25次。

3.一种如权利要求1所述重组人HMBOX1表达载体的表达产物，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种如权利要求3所述重组人HMBOX1表达载体的表达产物的制备方法，具体步骤如下：

(1)将权利要求1所述的重组人HMBOX1表达载体接种到含氨苄青霉素的LB培养基中培养，培养至OD₆₀₀为0.4后，加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度1mM，在30℃继续诱导培养4小时，得诱导菌液；

(2)将步骤(1)制得的诱导菌液用Ni-NTA交联的琼脂糖亲和层析进行纯化，纯化后的HMBOX1蛋白再一次进行Ni-NTA交联的琼脂糖亲和吸附，并直接在柱上呈梯度降低变性剂尿素的浓度对蛋白进行复性，最后收集复性蛋白，即为重组人HMBOX1表达载体的表达产物。

5.如权利要求4所述的重组人HMBOX1表达载体的表达产物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的具体步骤如下：

1)用蒸馏水浸湿空柱，弃去蒸馏水；

2)吸取2ml NTA-Resin树脂到空柱中，使其自然沉积，然后拔掉下端塞子，使液体流出；

3)依次用3ml蒸馏水；5ml 1×Charge Buffer，含有50mM NiSO₄；3ml 1×Binding Buffer含有0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，5mM imidazol，6M尿素，pH7.9；过柱子，加载Ni离子；

4)将以6M尿素溶解的包涵体蛋白通过柱子，流速10ml/h；

5)然后依次用5ml 1×Binding Buffer和5ml 1×Wash Buffer洗涤柱子，其中5ml 1×Wash Buffer含有0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，60mM imidazol，6M尿素，pH7.9；

6)依次加入梯度尿素1×Binding Buffer溶液；

7)加入5ml 1×Wash Buffer含有0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，60mM imidazol，洗涤；

8)加入4ml 1×Elute Buffer含有0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，1M imidazol pH7.9，洗脱，收集流出液，为复性蛋白，即重组人HMBOX1表达载体的表达产物；

所述步骤6)中的尿素的浓度梯度分别为：

6M尿素2ml、5.5M尿素1ml、5M尿素1ml、4.5M尿素1ml、4M尿素1ml、3.5M尿素1ml、3M尿素1ml、2.5M尿素1ml、2M尿素1ml、1.5M尿素1ml、1M尿素1ml、0.5M尿素1ml、0M尿素2ml。