[发明专利]一种绿麦芽抗菌蛋白分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质分离纯化技术领域，涉及采用缓冲液浸提、硫酸铵分级沉淀和各种层析技术相结合的绿麦芽抗菌蛋白分离纯化方法。

背景技术

大麦和酵母是啤酒制造的主要原料，大麦对酵母的影响一直是人们研究的热点，大麦中抗菌蛋白对酵母的毒害作用一直受人们的关注。Okada(1970)等从小麦和大麦中分离了一种对酵母有毒性的物质。它是一种抗蛋白水解和抗热的多肽，但在二价钙离子存在的条件下，其对酵母的影响会减弱，提到用0.05M的硫酸浸提大麦得到的蛋白对酵母有毒害作用的物质有：抗菌素，非特异脂移蛋白、硫堇等，其提取方法工艺复杂，提取时间较长。Barry C.Axcell(2000)提出不彻底发酵现象与对酵母毒害作用可能是相互联系的，而且主要的原因可能是脂类转移蛋白的抗菌多肽或硫堇类，并提出能部分提纯这种蛋白。Sandra N.E.vanNierop(2008)采用0.05M硫酸提取后，直接用透析袋透析，后冷冻干燥，加乙腈去除不容物，得到抗菌蛋白的复合物，含抗菌肽、抗菌素、硫堇等，但是没有对其分离纯化。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种用绿麦芽制备抗菌蛋白的分离纯化方法。本发明通过高效提取大麦芽蛋白，硫酸铵分级沉淀抗菌活性物质和各种层析柱层析技术分离纯化抗菌蛋白，经SDS-PAGE电泳显示为一条单带，分子量大致在16kda左右。

本发明绿麦芽蛋白制备抗菌蛋白的方法，包括如下步骤：

第一步、绿麦芽抗菌蛋白粗提液的制备，将绿麦芽粉碎后，与0.05M硫酸以1∶3～7混合，冰浴或4～6℃提取2～4小时，每隔10～15min搅拌一下，用离心机离心取上清，采用碱中和调PH为6.5～7.0，加硫酸铵分级沉淀，离心弃上清，用水复溶抗菌蛋白，将复溶的抗菌蛋白加到排阻1000Da的透析袋中，pH7～8、0.02～0.05mol/L Tis-HCl缓冲液透析至无硫酸根离子，浓缩样品，得到绿麦芽抗菌蛋白粗提液。

第二步、将第一步得到的麦芽抗菌蛋白粗提液按顺序依次通过阴离子交换柱层析、分子筛柱层析和阳离子交换柱层析，使绿麦芽抗菌蛋白分离纯化。

(1)阴离子交换柱层析：

填料：DEAE纤维素52；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7～8；平衡体积：200ml；流速：1ml/Tub/1min；洗脱液：50mmol Tis-HCl，pH7～8和含0.5mol/l的50mmol Tis-HCl，pH7～8；上样：绿麦芽抗菌蛋白粗提液；UV280nm检测，收集未吸附的蛋白，并冷冻干燥成干粉。

(2)分子筛柱层析

填料：葡聚糖凝胶G-50；柱体积：1.6×40cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7～8；流速：3ml/Tub/7min；洗脱液：50mmol Tis-HCl，pH7～8；上样：经阴离子交换柱层析分离的未吸附并冻成干粉的蛋白经洗脱液溶解后上样；检测波长：280nm；收集有抗菌活性峰，并冷冻干燥冻成干粉；

(3)阳离子交换柱层析

填料：羧甲基葡聚糖C-50；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol柠檬酸-磷酸盐，pH5～6；洗脱液：50mmol柠檬酸-磷酸盐，pH5～6；洗脱体积：200ml；流速：3ml/Tub/6min；检测波长：280nm；上样：经分子筛柱层析分离的有抗菌活性的蛋白干粉，经加洗脱液溶解后上样；无需梯度洗脱，收集有抗菌活性峰，并冷冻干燥。

上述的方法在实际操作中可以是：

第一步、绿麦芽抗菌蛋白粗提液的制备

取绿麦芽粉粹后过40～80目筛的粉末与0.05M硫酸以1∶5～6混合，冰浴或4～6℃提取2～4小时(每隔10～15min搅拌一下)，用离心机8000转/分、离心15分钟，取上清，用氢氧化钠调到pH7.0，加入硫酸铵分级沉淀，收集硫酸铵饱和度30％～80％之间的蛋白，用排阻1000Da的透析袋透析，透析后离心10000转/分、离心10分钟，取上清，上清即为抗菌蛋白粗提液。

第二步、阴离子交换柱层析：填料：DEAE纤维素52；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7.8；平衡体积：200ml；流速：1ml/Tub/1min；洗脱液：50mmol Tis-HCl，pH7～8和含0.5mol/l的50mmol Tis-HCl，pH7～8，；上样：浓缩后的绿麦芽抗菌蛋白粗提液；UV280nm检测，收集未吸附的蛋白，并冷冻干燥成干粉；