[发明专利]一种绿麦芽抗菌蛋白分离纯化方法

权利要求书

1、一种绿麦芽抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤：

第一步、绿麦芽抗菌蛋白粗提液的制备，将绿麦芽粉碎后，与0.05M硫酸以1∶3～7混合，冰浴或4～6℃提取2～4小时，每隔10～15min搅拌一下，用离心机离心取上清，采用碱中和调PH为6.5～7.0，加硫酸铵分级沉淀，离心弃上清，用水复溶抗菌蛋白，将复溶的抗菌蛋白加到排阻1000Da的透析袋中，pH7～8、0.02～0.05mol/L Tis-HCl缓冲液透析至无硫酸根离子，浓缩样品，得到绿麦芽抗菌蛋白粗提液；

第二步、阴离子交换柱层析：

填料：DEAE纤维素52；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7～8；平衡体积：200ml；流速：1ml/Tub/1min；洗脱液：50mmol Tis-HCl，pH7～8和含0.5mol/l的50mmol Tis-HCl，pH7-8；上样：绿麦芽抗菌蛋白粗提液；UV280nm检测，收集未吸附的蛋白，并冷冻干燥成干粉；

第三步、分子筛柱层析：

填料：葡聚糖凝胶G-50；柱体积：1.6×40cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7～8；流速：3ml/Tub/7min；洗脱液：50mmol Tis-HCl，pH7～8；上样：经阴离子交换柱层析分离的未吸附并冻成干粉的蛋白经洗脱液溶解后上样；检测波长：280nm；收集有抗菌活性峰，并冷冻干燥冻成干粉；

第四步、阳离子交换柱层析：

填料：羧甲基葡聚糖C-50；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol柠檬酸-磷酸盐，pH5～6；洗脱液：50mmol柠檬酸-磷酸盐，pH5～6；洗脱体积：200ml；流速：3ml/Tub/6min；检测波长：280nm；上样：经分子筛柱层析分离的有抗菌活性的蛋白干粉，经加洗脱液溶解后上样；无需梯度洗脱，收集有抗菌活性峰，并冷冻干燥。

2、根据权利要求1所述的一种绿麦芽抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于其具体操作步骤是：

第一步、绿麦芽抗菌蛋白粗提液的制备，取30克的绿麦芽粉粹后过40～80目筛的粉末与0.05M硫酸以1∶5～6混合，冰浴或4～6℃提取2～4小时，每隔10～15min搅拌一下，用离心机8000转/分、离心15分钟，取上清，用氢氧化钠调到6.5～7.0，加入硫酸铵分级沉淀，收集硫酸铵饱和度30％～80％之间的蛋白，用排阻1000Da的透析袋透析，透析后离心10000转/分、离心10分钟，取上清，上清即为抗菌蛋白粗提液，并浓缩至3ml；

第二步、阴离子交换柱层析：填料：DEAE纤维素52；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7～8；平衡体积：200ml；流速：1ml/Tub/1min；洗脱液：50mmol Tis-HCl，pH7～8和含0.5mol/l的50mmol Tis-HCl，pH7～8；上样：浓缩后的绿麦芽抗菌蛋白粗提液3ml；UV280nm检测，收集未吸附的蛋白，并冷冻干燥成干粉；

第三步、分子筛柱层析：填料：葡聚糖凝胶G-50；柱体积：1.6×70cm；平衡液：50mmol Tis-HCl，pH7-8；流速：3ml/Tub/7min；洗脱液：50mmolTis-HCl，pH7-8；上样：经DEAE纤维素52层析，未吸附并冻成干粉的蛋白，经平衡液1-2ml溶解后上样；检测波长：280nm；收集有抗菌活性峰，并冻成干粉；

第四步、阳离子交换柱层析：填料：羧甲基葡聚糖C-50；柱体积：1.6×20cm；平衡液：50mmol柠檬酸-磷酸盐，pH5～6；洗脱液：50mmol柠檬酸-磷酸盐，pH5～6；洗脱体积：200ml；流速：3ml/Tub/6min；检测波长：280nm；上样：经葡聚糖凝胶G-50分离的有抗菌活性的蛋白干粉，经加洗脱液3ml溶解后上样；无需梯度洗脱，收集有抗菌活性峰，并冷冻干燥。