[发明专利]用于H5亚型流感病毒通用检测的结合蛋白和表位阻断ELISA

说明书

发明领域

本发明涉及开发一种用于检测禽流感病毒抗体的特异性血清学分析。更具体地，本发明涉及单克隆抗体的制备，所述单克隆抗体与所有已知的H5流感病毒亚型强烈反应，但不与非H5流感亚型交叉反应，其用于开发用于检测人和非人动物中H5流感亚型的血清抗体和相关结合蛋白的表位阻断ELISA。

背景技术

禽流感病毒(AIV)是禽类常见疾病。1996年在中国广东省饲养的鹅中发现第一例家禽的H5N1亚型AIV的感染，1年后在香港发现第一例人的H5N1亚型AIV感染[1]。从那时起，H5N1 AIV造成禽流感的爆发，其波及世界许多地区。迄今为止受影响的地区包括欧洲，中东和特别是亚洲[2]。根据世界卫生组织(WHO)的最新报告，总共有328例确认的人H5N1禽流感病例，其中200例导致患者的死亡。在这328个病例中，据报道绝大多数(106例，85例死亡)来自印度尼西亚[3，4]。根据WHO，基于病毒进化为能够有效的在人与人之间传播的毒株，全球现在处于大范围流行警报的第3级(共6级)[5]。

在2006年6月，印度尼西亚33个省中的27个报道了家禽中H5N1的爆发，导致超过1600万只家禽因为患病和扑杀而死亡[6]。养禽业因为禽流感损失数百万元。这种损失影响了数百万靠家禽维生的人的收入。HPAI(H5N1)在家禽中的这种爆发以及现在人类中病例数的增加引起大家的关注。在爆发初期准确并及时检测病原体存在的能力将大大有利于控制疾病。此外，它可以减少抗生素滥用并以及时方式提供使用抗病毒治疗的选择。

可用于流感诊断的各种方法包括病毒分离，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)的病毒抗原检测，通过RT-PCR的分子检测和血清测试。标准病毒分离步骤具有需要数天来获得结果的缺点，从而限制了临床医生对其的使用。RT-PCR的缺点包括涉及的高成本，技术熟练人员的要求，污染的可能性以及假阳性结果的后续风险。此外，因为抗原性漂移，PCR引物可能需要持续更新[7]。病毒中和，血细胞凝集抑制(HI)，ELISA和免疫印迹测试是血清学诊断的优选方法。但是，中和测定和HI测定不被认为是高度灵敏的和需要进一步进行亚型分析，并且是高劳动强度和耗时的[8，9]，因此不适于血清的大规模常规检验。ELISA已经被广泛用作研究大量样品的预筛选工具，但市场上只能买到针对鸡和火鸡血清的间接ELISA系统，因为没有提供其他物种的种特异性二抗。间接ELISA的进一步限制是要求高的抗原纯度。但是，间接ELISA的最显著缺点在于已知HA抗原与病毒的其他亚型交叉反应。因此，间接ELISA不是可靠的检测方法。

大部分这些方法不仅是麻烦和高劳动强度的，并且耗时和包括获得假阳性结果的风险。这些技术的进一步限制是流感病毒是碎裂的基因组RNA病毒，已知其经历连续的突变和遗传重组(抗原性漂移)，使其难于检测病毒[10]。

考虑到这些常规测定的缺点，并且因为AIV感染对野生动物、家养动物和人的风险，急需一种新的测定法，其能快速、易用和特异性的用于检测AIV的H5亚型。本发明代表了在AIV H5亚型的诊断和监测方面的突破。

发明概述

根据本发明，提供了对流感H5亚型HA蛋白特异的单克隆抗体和相关结合蛋白。所述抗体可用于哺乳动物和禽类血清样品包括人血清样品中流感H5感染的血清学诊断。更具体地，每种抗体可用于高灵敏和特异性表位阻断ELISA以检测人和其他动物中的流感H5亚型。每种抗体均与多种H5亚型株强烈反应但不显示与非H5流感亚型的交叉反应性。

因此，本发明包括与禽流感病毒H5亚型的表位结合的结合蛋白，其基本上具有单克隆抗体5F8或单克隆抗体1G5的免疫结合特性。结合蛋白可以是单克隆抗体、抗体片段、嵌合抗体或人源化抗体和优选是单克隆抗体。

本发明还包括结合蛋白，其与氨基酸序列为CNTKCQTP的AIV H5血凝素的表位结合。本发明还包括结合蛋白，其与氨基酸序列为IHPLTIGE的AIV H5血凝素的表位结合。

另一方面，本发明包括一种检测生物样品中H5亚型AIV的方法，其包括将样品与包含H5亚型血凝素糖蛋白的表位的抗原接触并确定样品中的抗体是否结合所述表位。优选通过表位阻断ELISA进行结合确定。优选H5亚型血凝素糖蛋白的表位包括序列CNTKCQTP或序列IHPLTIGE。IHPLTIGE和CNTKCQTP表位存在于所有已知的人H5N1 AIV株、基本上所有已知的鸡H5N1AIV株和基本上所有已知的其他动物和禽类的H5N1株中，并且是非常稳定和高度抗原性的，使其非常适用于诊断H5N1感染。