[发明专利]抗体制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗体制备方法。

背景技术

众所周知，在疾病诊断、治疗方面，弄清生物体防御机能、尤其是其核心免疫机能，正逐渐成为重要课题。例如，在诊断除癌症、糖尿病等生活习惯病以外的其他各种疾病时使用的各种方法中，提出了能像可目视检测与疾病密切相关的标记物的浓度、量的免疫胶体层析法一样可更简便诊断的方法，研究用试剂、诊断用试剂、各种物质监测用试剂、免疫学诊断、治疗领域被进一步扩大，但所述方法中抗体的稳定确保将在今后变得越来越重要。另外，开发出了利用噬菌体展示系统的抗体库制备技术，分离人抗体也成为可能。

另外，制备免疫学测定中必要的单克隆抗体时，首先要向小鼠中注射抗原(免疫)，此步骤需要约3个月。之后提取产生抗体的B细胞群，与骨髓瘤细胞进行细胞融合。通过此步骤构建出可无限增殖的抗体产生细胞(杂交瘤)群。最后从该杂交瘤细胞群中筛选能产生目的抗体的细胞(克隆)，用该细胞进行抗体的大量制备。此克隆步骤中，需要稀释杂交瘤细胞群，使1孔只含1个细胞的状态，从1细胞开始进行培养。使其增殖到可进行抗体性质研究的细胞浓度，再对所得单克隆抗体的性质进行检查。对呈阳性的孔再次进行稀释，进行与上述相同的检查。重复实施该操作几次，便分离得到耐用的杂交瘤细胞。此步骤1个周期需要约2周，也有整体需要3个月以上的情况。上述制备单克隆抗体的方法费时费力，且需要依赖专业人员，制备抗体成本高昂。

这里例举公知文献对抗体制备方法进行具体说明，特开平10-282097号公报中记载了对以佐剂物质、细胞因子的组合为特征的抗原的特异性免疫方法。特开2004-121237号公报中记载了如下制备特异性抗体的方法，其特征是，按照诱导抗体产生应答的方法，将诱导出抗原特异性抗体的产生应答的末梢血淋巴细胞通过EB病毒永生化，分离抗原特异性B细胞，制备产生抗原特异性抗体的B细胞，及进一步培养上述B细胞。特开2006-180708号公报中记载了如下抗体制备方法，其包括：将经标记抗原与靶细胞结合的步骤、分离经标记靶细胞的步骤、制备抗体基因步骤、用表达载体表达抗体基因的步骤。此外，特表2006-516408号公报中记载了经过一系列步骤，由目的抗体制备人源化高亲和力抗体的方法。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种新的抗体制备方法，其比以往费时费力的抗体制备方法用时更短，制备更容易。

本发明基于这些新抗体制备方法，以实现在作为肾癌标记物而被广泛关注的S100A10蛋白免疫学测定、治疗中有效的抗体制备方法为目的。S100A10蛋白如高山达也等，肾癌细胞中S100A10蛋白的特异性表达，肾癌研究会会报，28：9-10，2005中所述，可作为肾癌标记物使用，由于该标记物也可从尿成分中获得，因此在简便诊断肾癌中应用价值很高。

为达成这些目的，本发明提供一种抗体制备方法，包括：将含免疫用细胞的组织在含抗原和刺激物的培养液中体外免疫的步骤；筛选所述经免疫的细胞的步骤；及从筛选出的免疫细胞获得抗体的步骤。

即本发明使用所谓体外免疫法，在添加了特定刺激物的培养液中得到由抗原所致的致敏免疫细胞，能够实现用通常所需时间的几十分之一的时间来制备抗体。

更详细而言，首先，如果异物(抗原)进入体内，则巨噬细胞、树突状细胞将其摄入细胞中。异物在细胞内分解，将分解产物呈递到细胞膜表面。接着幼稚T细胞靠近分解产物，通过幼稚T细胞表面的T细胞受体(TCR)识别抗原，经此过程活化T细胞，成为辅助T细胞(Th2)。

另一方面，B细胞也是通过将侵入体内的异物(抗原)用细胞表面上的B细胞受体(BCR)识别而摄入细胞内。被摄入的抗原被快速分解，分解产物被呈递到II类MHC分子上。此时，被称为CD40的分子也同时在细胞膜表面表达。

通过上述方法可使Th2和抗原呈递B细胞靠近，相互识别，开始活化B细胞及抗体的类别转换。此时，未发现不是用相同抗原活化的分子则发生的现象。

其中，上述情况中的免疫反应虽然在体内实施，但使所述免疫反应在体外发生的方法是所谓的体外免疫法。