[发明专利]有生物学活性的、含C-端精氨酸的肽

说明书

发明领域

本发明关注来自蛋白胨的活性肽片段的分离、鉴定和表征。

发明背景

常常将动物和植物组织的水解产物添加至原核和真核细胞的培养基以提高存活细胞数目和重组蛋白质产物滴度。如此，在细胞培养基配方中已经广泛采用了来自多种多样来源的蛋白胨来增强细胞培养物生长、寿命和生产率。然而，由于它们不明确的性质，它们作为用于治疗性蛋白质生产的培养基添加剂的存在呈现了数项挑战。

动物衍生成分作为用于由哺乳动物细胞生产治疗性蛋白质的培养基添加剂的使用会引起病毒、支原体和朊病毒污染(Kallel等，J.Biotechnol.95：195-204(2002))。避免在细胞培养基使用动物衍生成分的努力得到了欧洲和美国管理当局的支持(Castle和Roberston，Dev.Biol.Stand.99：191-196(1999))。在过去的几十年里已经自培养基中成功消除了动物血清，而且大多数当前使用的培养基被证实是不含蛋白质的(Froud，Dev.Biol.Stand.99：157-166(1999))。然而，转换成不含蛋白质的培养基常常导致细胞生长和生产力的损失(Lee等，J.Biotechnol.69：85-93(1999))。

结果是，常常在细胞培养基中使用蛋白质水解产物(也叫作蛋白胨(peptone))作为营养添加剂，因为它们中的一些可以认为是不含蛋白质的(Burteau等，In Vitro Cell.Dev.Biol.-Anim.39(7)：291-296(2003))。用于细胞培养的蛋白胨通常通过各种各样的基于生物学的起始材料(动物组织、奶衍生产品、微生物或植物)的酶促消化来制造。

蛋白胨的总体效果是增强细胞生长和提高生产率(productivity)，且产品品质与标准培养基相比相同(Jan等，Cytotechnology 16：17-26(1994)；Heidemann等，Cytotechnology 32：157-167(2000)；Sung等，Appl.Microbiol.Biotechnol.63：527-536(2004))。数份论文显示了蛋白胨含有诸如游离氨基酸、寡肽、铁盐、脂质和痕量元素等物质(Franek等，Biotechnol.Prog.16：688-692(2000)；Martone等，Bioresour.Technol.96：383-387(2005))。一项研究调查了蛋白胨的潜在作用，并显示了它们会具有营养效果(Heidemann等，Cytotechnology 32：157-167(2000))。同样，Schlaeger，J.Immunol.Meth.194：191-199(1996)证明了一种特定的蛋白质水解产物展示出抗凋亡特性。

尽管对蛋白胨在细胞培养中的效果进行了众多调查，它们的作用机制仍然未知。而且即使已经显示了蛋白胨在细胞培养过程中是有益的，然而它们的使用也具有许多缺点。首先，由于有些蛋白胨是动物衍生的，因此产生以使用血清相似的问题。另外，来自其它来源的蛋白胨也可能是外来因子(adventitious agent)的潜在来源。其次，蛋白胨中的“活性”成分及其作用机制的不确定性使之难以测量细胞培养制备过程中所使用的蛋白胨批次的品质(如果不是不可能的话)。最后，因为蛋白胨制备的来源材料和工艺不是标准化的或普遍可互换的，所以蛋白胨自身本性是单一来源的原材料。因此，有机会更好地表征蛋白胨以减少或消除这些缺点。

因此，了解蛋白胨中活性成分的组成和特性以创建已很好确定可再生产浓度的、包含详细说明活性成分的“确定成分培养基”会是有利的。另外，通过打开控制细胞生长和死亡及更好地控制重组蛋白质表达的窗口，活性蛋白胨成分的鉴定预期导致更好地了解重组宿主细胞和细胞系的生理学状况。

因此，本文付出了努力来表征蛋白胨组成和了解它们对细胞培养的效果的机制。

本发明基于将动物衍生的蛋白胨(PP3)分级成可鉴定的成分，并且通过应用现代分析技术(包括高分辨率质谱术)来研究这些化合物的性质。本发明至少部分基于以精氨酸为末端的二肽和三肽在PP3的促进生长和提高滴度的活性中发挥作用的认识。

发明概述

一方面，本发明关注式(X1)_nX2R的肽，

其中X1和X2可以相同或不同，且独立代表精氨酸以外的任何氨基酸；

n为0或1；且

R代表精氨酸，

其中所述肽展现出蛋白胨生物学活性。

在一个实施方案中，所述肽是通过对蛋白胨(诸如PP3蛋白胨)分级获得的。