[发明专利]用一类基于与组氨酸结合生成荧光基团的铱配合物标记抗体

说明书

技术领域

该发明涉及一种新颖的生物标记方法，即通过一类自身无荧光的金属铱配位化合物与蛋白质上的组氨酸残基结合，形成可被激发的荧光基团，从而得以标记抗体分子，并用于免疫分析检测、免疫荧光成像等生物技术领域。

背景技术

生物分子的荧光标记是应用生物技术中的重要组成部分，被荧光基团标记的生物分子如抗体、多肽及核酸等通过分子间相互作用，识别目标分子，后通过高灵敏的光学方法或电化学方法(光致发光、荧光共振能量转移、时间分辨、电化学发光)获取标记分子产生的信号，以此形成一系列基于荧光标记的检测手段，被广泛地应用于各种生命科学基础研究、临床医学诊断、食品卫生安全等领域。常见的荧光标记物包括有机小分子(如罗丹明和荧光素等)、无机过渡金属配位化合物(如三联吡啶钌)，以及金属和半导体纳米颗粒(如量子点)等，这些材料可以通过化学修饰的手段，在其上引入可被活化的化学基团，通过共价交联方式标记生物分子。

蛋白质和多肽的表面分布着大量较活泼的化学基团，例如α-氨基(-NH₂)、羧基(-COOH)、巯基(-SH)和羟基(-OH)等。其中，位于蛋白质N末端或赖氨酸残基侧链末端的α-氨基，以及位于半胱氨酸残基侧链末端的巯基最常被用于同标记化合物或交联剂(crosslinker)交联^【1】。同α-氨基发生反应的基团包括经过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化后的羧基，或者是其进一步与氮羟基琥珀酰亚胺(NHS)形成的较稳定的活性琥珀酰亚胺酯中间体，两者皆可与氨基交联形成稳定的肽键；另外，氨基也可以同异硫氰酸基团(-N＝C＝S)发生定量反应并以硫脲键进行交联。同巯基发生反应的包括马来酰亚胺基团，含有该基团的交联剂可以与蛋白质上的巯基形成稳定的硫醚键。以上这些反应方式目前应用比较广泛，有些需要在交联基团的活化过程中添加额外的试剂，这就意味着需要更多的反应步骤和时间来完成标记；有些商业销售的标记化合物则被预先活化以方便用户，但这些化合物受到稳定性和反应条件的限制，不能长期保存。此外，在实际工作中，以上提到的标记基团的可选择性比较有限，通常在被标记物中进行一种类型的标记(如-NH₂同-COOH或-SH的交联反应)之后，即难以进行第二，以至第三种标记。

组氨酸由于其侧链的咪唑基团上的两个N原子各含有一对孤电子，因而具有较强的与二价金属离子(如Zn++，Ni++，Cu++)的配位能力，这一特性在许多研究和应用中得到验证。比如，人血液中存在有一种富组氨酸的糖蛋白(histidine-rich glycoprotein，HRG)，在pH和Zn++浓度的调节下，HRG上组氨酸通过与Zn++的络合，引起一系列蛋白结构的变化和信号转导，最终引发细胞凋亡，抑制血管的生成^【2】。又如，6联组氨酸序列(His₆)与Ni++的络合能力被研究者开发成为一种使用极为广泛的蛋白质表达纯化手段，德国QIAGEN公司开发的用于纯化和检测His₆标签蛋白的试剂盒，即利用了组氨酸与Ni-NTA可逆的高亲和力相互作用^【3】。在此基础上，通过在Ni-NTA上交联荧光基团，His₆序列与Ni-NTA的高亲和力也被发展用于His₆标签蛋白的荧光标记，但所报道的这些标记基团在结合蛋白前后没有荧光强度的改变，不仅需要序列中包含连续的6个组氨酸残基，且荧光标记结构庞大，应用受到限制^{【4】【5】}。组氨酸与Cu++的络合能力也被广泛地研究，其中有研究者利用含共轭芳香环的化合物与铜离子结合，制备成为一种荧光探针，利用竞争置换法检测溶液中游离的组氨酸，该方法虽然灵敏度较高，但从其反应原理上(置换法)无法进行多肽和蛋白质的标记^【6】。

本发明的特色是利用新型的过渡金属铱配位化合物，直接地、特异性地标记多肽和蛋白质(抗体)中的单个组氨酸残基，标记前后荧光强度大大增强，形成的荧光基团分子量小，标记过程简单快速，形成的产物化学性质稳定，光学性质优良，可以广泛用于免疫检测、分子示踪等领域。

发明内容

本发明是利用一类环金属铱配位化合物，对抗体、多肽等蛋白质进行标记，发明内容包括标记过程与分析方法，以及标记产物用于进一步的生物分析。

两个此类化合物的结构如式I所示。