[发明专利]布氏杆菌荧光量子点偶联抗体检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及布氏杆菌荧光量子点偶联抗体检测方法，更具体地说是采用纳米生物技术制备和纯化偶联布氏杆菌特异性抗体的量子点的方法，尤指一种水溶性半导体荧光量子点与布氏杆菌特异性抗体偶联和纯化的方法，获得的偶联抗体适用于布氏杆菌的现场快速检测，属于检验检疫领域。

背景技术

纳米技术是目前国际上基础研究和高新技术发展中最具有前瞻性、带动性的重点领域之一。纳米材料因具有独特的物理化学性质，其巨大的比表面积，特异的反应活性和纳米效应，使其大异于传统材料，在发展快速、高灵敏度、高准确性检测技术和传感手段方面具有极大的潜力。我国在纳米生物材料的设计、研发、表征和潜在应用领域成果层出不穷。研究并利用新型纳米生物材料的特性，结合现有的检测技术，实现口岸快速、高特异、高敏感检验目的，开发具有我国自主知识产权的病原富集、纳米与生物活性物质标记及检测技术，对占领纳米材料应用性研究领域的制高点具有重要的战略意义。

在严重危害人畜健康的病原微生物检测方面，利用带有荧光的无机纳米颗粒与生物细胞或蛋白质的偶联，开展生物检测具有重大应用前景。但在目前，纳米材料与蛋白质偶联是一个世界性难题。主要难点包括纳米材料水溶性的问题；纳米材料表面基团的活化；抗体分子和纳米材料的共价结合；偶联条件必须能保证纳米材料和抗体活性不能受损；之外还要求偶联后能有效去除未偶联的抗体分子。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是：提供一种布氏杆菌荧光量子点偶联抗体检测方法。通过反应条件优化，实现特异性抗体与量子点的偶联。并对产物纯化方法进行研究，从而建立量子点与抗体偶联与纯化的方法。

本发明要解决的另一个技术问题是：将纯化的量子点偶联抗体用于布氏杆菌等病原微生物的快速检测，建立一种新的病原微生物检测技术。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种布氏杆菌荧光量子点偶联抗体检测方法，包括如下步骤：

(1)将量子点、布氏杆菌多克隆抗体和偶联剂混合，室温反应2小时，得到含有偶联有布氏杆菌抗体的量子点的溶液；

(2)纯化偶联产物，去除未反应的布氏杆菌多克隆抗体和量子点；

(3)偶联产物和涂布在载波片上的待测样品反应，冲洗掉游离的偶联产物后，进行荧光检测，有荧光表示待测样品中含有相应抗原。

所述步骤(1)将量子点、布氏杆菌多克隆抗体和偶联剂混合，得到含有偶联有布氏杆菌多克隆抗体的量子点的溶液，是指将量子点、偶联剂和布氏杆菌多克隆抗体按1μmol：1-6mg：0.91mg的比例混合。

所述的量子点(quantumdots，QD)是指半导体纳米粒子，也可称为半导体纳米晶(manocrystals，NC)，是一种由II-IV族元素组成的纳米颗粒。本发明使用的量子点是水溶性量子点，优选水溶性量子点CdTe。

所述“偶联剂”是指可以使抗体和量子点进行共价结合的试剂。由于抗体的结构特征和量子点被修饰羧基的原因，选择的偶联剂应符合下列条件的一种：能活化羧基，使活化的羧基与抗体上的氨基反应，形成肽键。本发明使用的偶联剂为乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)或N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，也可将二者混合进行偶联。优选为单独使用EDC。

所述步骤(2)纯化偶联产物的方法一为分子筛法纯化，分子筛为sephadex G100。

所述步骤(2)纯化偶联产物的方法二为离心法纯化，离心条件为4℃，6000-12000r/min，离心10-20min，所得沉淀即为纯化的偶联有布氏杆菌多克隆抗体的量子点。

所述的“布氏杆菌多克隆抗体”是指通过布氏杆菌可溶性抗原于哺乳动物皮下注射，进行多次免疫，收集被免疫动物的血清，经纯化得到布氏杆菌可溶性特异抗体。

本发明通过对荧光量子点和布氏杆菌特异性抗体分子特性的研究，通过对各种偶联条件进行优化，选择合适的偶联剂品种和浓度，可以将水溶性的量子点与特异性的抗体进行共价偶联，得到功能化的量子点，这种生物功能化量子点与涂布在载波片上的布氏杆菌通过免疫特异性结合，来定性和定量地检测布氏杆菌，实现了布氏杆菌的现场快速检测。

本发明的优点是：

1)本发明提供的方法具有极低的检测限。

2)本发明提供的方法灵敏度高、特异性强。

3)本发明提供的方法可同时检测多种布氏杆菌抗原成分。

4)本发明提供的方法快速、简便，而且设备简单、成本低廉。

5)快速，可用于布氏杆菌的现场快速检测。

附图说明