[发明专利]抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中禽流感病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中禽流感病毒的方法，更具体地说是一种磁性纳米颗粒与抗体偶联和纯化的方法，获得的偶联抗体适用于禽流感病毒等病原微生物的富集，从而能从水中或者其它环境样品中快速检测出禽流感病毒，属于检验检疫领域。

背景技术

禽流感(Bird Flu或Avian Influenza)是由禽流感病毒引起的一种急性传染病。截止到2008年4月(2003年始)，世界卫生组织共报告高致病性人禽流感确诊病例378例，分别来自14个国家，死亡率高达63％。由于禽流感的高死亡率以及人类对禽流感病毒普遍缺乏免疫力，研究禽流感病毒的任务十分艰巨。目前对于禽流感病毒的检测已经有许多方法，例如病毒分离、RT-PCR、ELISA、荧光RT-PCR等，但这些方法无疑都存在检出率的问题，如果样品中病毒含量没有达到该检测方法的检测下限，就检测不出来，因此本领域迫切需要一种富集禽流感病毒的方法，同时具有灵敏快速和设备简单、成本低廉的特点，以便更好更快的诊断、治疗和预防禽流感。

纳米技术是目前国际上基础研究和高新技术发展中最具有前瞻性、带动性的重点领域之一。纳米材料因具有独特的物理化学性质，其巨大的比表面积，特异的反应活性和纳米效应，使其大大异于传统材料，在发展快速、高灵敏度、高准确性检测技术和传感手段方面具有极大的潜力。我国在纳米生物材料的设计、研发、表征和潜在应用领域成果层出不穷。研究并利用新型纳米生物材料的特性，结合现有的检测技术，实现口岸快速、高特异、高敏感检验目的，开发具有我国自主知识产权的病原富集、纳米与生物活性物质标记及检测技术，对占领纳米材料应用性研究领域的制高点具有重要的战略意义。

磁性纳米颗粒是由Senyei A E在1978年首先研制出来的一种新型的纳米功能材料。它的内部是一个磁核，因而在外部磁场的作用下，微球可以定向移动；外部是一层高分子层，表面分布着许多活性基团，可以和细胞、蛋白质、核酸、酶等生化试剂发生偶联，进而在磁场的作用下实现分离。磁性纳米颗粒从诞生开始，它就受到了科研工作者的关注，并且在生化分析领域得到成功的应用。利用磁性纳米颗粒分离蛋白质、酶、抗体、细胞，所需设备简单、操作简便同时分离速度快，效率高，并且能保持样品的生物活性，因此近年来在生物医药等领域，磁性纳米颗粒已被广泛应用于免疫分析、核酸分析、细胞分离、酶的固定等多个领域。

将磁性纳米颗粒包被上特异性抗体、受体、单链DNA，用于分离复杂样品中的靶体，取得巨大成功。与传统的分离方法相比，把磁性纳米颗粒用于复杂组分的生化样品的分离，能够实现分离和富集同时进行，大大提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提高。目前，已经有相关的文章报道了将磁性纳米颗粒应用于检测环境样品中的痕量微生物或者某些活性化学物质，取得了很好的效果。但在目前，纳米材料与蛋白质偶联是一个世界性难题。主要难点包括纳米材料水溶性的问题；纳米材料表面基团的活化；抗体分子和纳米材料的共价结合；偶联条件必须能保证纳米材料和抗体活性不能受损；之外还要求偶联后能有效去除未偶联的抗体分子。

技术内容

本发明要解决的第一个技术问题是：提供一种抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中禽流感病毒的方法，通过反应条件优化，实现特异性抗体与磁性纳米颗粒的偶联，并对产物纯化方法进行研究，从而建立磁性纳米颗粒与抗体偶联与纯化的方法。

本发明的要解决的另一个技术问题是：将纯化的磁性纳米颗粒偶联抗体用于禽流感病毒等病原微生物的富集，并采用快速检测方法对富集效果进行验证，建立一种新的特异性的禽流感病毒快速分离、富集的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

抗体偶联的磁性纳米颗粒富集样品中禽流感病毒的方法，包括如下步骤：

(1)将磁性纳米颗粒、禽流感病毒多克隆抗体和偶联剂混合，室温反应2小时，得到含有偶联有禽流感病毒多克隆抗体的磁性纳米颗粒的溶液；

(2)纯化偶联产物，去除未反应的抗体；

(3)偶联产物和待测溶液反应后，用磁铁富集；

(4)富集产物的检测。

所述步骤(1)将磁性纳米颗粒、禽流感病毒多克隆抗体和偶联剂混合，得到含有偶联有禽流感病毒多克隆抗体的磁性纳米颗粒的溶液，是指将磁性纳米颗粒、偶联剂和禽流感病毒多克隆抗体按1-2μmol：1-6mg：0.625-5mg的比例混合。

所述“磁性纳米颗粒”是指超顺磁性的磁性纳米颗粒。