[发明专利]尖吻蝮蛇蛇毒血凝酶

说明书

技术领域

本发明涉及一种丝氨酸蛋白酶，具体地说是一种蛇毒血凝酶，本发明还涉及其分离纯化方法。

背景技术

据国内外文献的报导，在蝮亚科(Crotalinae)蛇毒中多存在一类与血液凝固相关的蛋白酶，通常称之为“类凝血酶”(thrombin-likeenzyme，简称：TLC)。类凝血酶与凝血酶(thrombin)的作用相似，可以使血浆中纤维蛋白原转化为纤维蛋白而“凝固”。现已在30多种蝮科蛇毒中发现并分离纯化出20余种TLC。到目前为止，已发现的TLC分子量多在30,000左右，大多数为酸性糖蛋白。

在以往已经发现的蛇毒TLC中，蛋白质一级结构多为单链，其代表产品“立止血”是由巴西矛头蝮蛇蛇毒中分离出的凝血酶，但在蝮亚科蛇毒TLC中也存在双链分子结构，链间由二硫键连接。Xin Cheng等(中国科技大学)1999年报导：从五步蛇(Agkistrodonacutus)中分离到一种“类凝血酶”，命名为“Agkisacutacin”。该蛋白由两条肽链构成，α-亚基分子量15kDa，β-亚基分子量14kDa。Agkisacutacin能够水解纤维蛋白原中的α链。肖昌华(中科院昆明动物研究所)2004年从五步蛇(Agkistrodon acutus)中分离到两种“类凝血酶”，均为双链分子结构。凝血酶I的A亚基含有132个氨基酸，分子量16,000Da；B亚基含有123个氨基酸，分子量14,000Da，酶比活性为：160U/mg。凝血酶II的A亚基含有122个氨基酸，分子量15,000Da；B亚基含有120个氨基酸，分子量13,000Da，酶比活性为：70U/mg。该两种TLC经药理实验证明：均具有止血功效。

我国具有丰富的蛇毒研究资源，本发明人从我国的尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus，俗称五步蛇)的蛇毒中分离得到一种高活性血凝酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛇毒血凝酶，其是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离得到的一种类凝血酶。

本发明的另一个目的在于提供一种分离纯化上述血凝酶的方法。

本发明血凝酶是从中国尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒中分离得到的高活性血凝酶。该酶具有如下特征：①酶蛋白分子量为29,800Dalton。②由α、β两个亚基构成，亚基链间由二硫键连接。③α亚基含129个氨基酸，分子量为15,500Dalton，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；β亚基含123个氨基酸，分子量为14,300Dalton，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。④酶活性可被苯甲基磺酰氟(PMSF)完全抑制，表明其是一种丝氨酸蛋白酶。

本发明还提供上述蛇毒血凝酶的纯化方法，其包括如下步骤：

1)、蛇毒预处理；

2)、将预处理后的蛇毒溶液上经预平衡的DEAE-Sephrose FF层析柱，用0.01M pH7.4PBS洗柱，再用含0～1M NaCl的0.01M pH7.4PBS分步洗脱，收集0.06M NaCl溶液的洗脱液；

3)、将上述洗脱液适当浓缩后透析或多次稀释超滤去除NaCl；

4)、将透析后的溶液再次上经预平衡的DEAE-Sephrose FF层析柱，用0.01M pH7.4PBS洗柱，再用含0～1M NaCl的0.01M pH7.4PBS分步洗脱，收集0.06M NaCl溶液洗脱液的最后洗脱峰；

5)、将上述洗脱液适当浓缩后透析或多次稀释超滤去除NaCl。

其中，步骤1)蛇毒预处理的方法是将蛇毒用适量预冷的0.01MpH7.4PBS溶解，离心取上清液进行透析或超滤(可用分子截留量为5000D的膜进行切向流超滤)，通过预处理可以去除不容的杂质以及小分子多肽，并降低溶液离子强度。

具体地说可通过如下步骤进行蛇毒的预处理：称取蛇毒若干克，用蛇毒重量20倍体积预冷的0.01M pH7.4PBS于4-8℃的层析柜中搅拌溶解30分钟，于4℃、10000g离心10分钟，将离心上清液倾入透析袋中，离心沉淀用PBS搅拌悬浮，再次离心。合并两次离心上清液于透析袋中，在层析柜中对0.01M pH7.4PBS透析24小时，中间换液3次，以去除小分子多肽和降低溶液离子强度。

如上所述，各透析步骤均可采用切向流超滤(选用截止值5000分子量膜)方法代替，通过稀释、超滤浓缩，再稀释再超滤浓缩的方式以去除小分子多肽和脱盐降低溶液离子强度。