[发明专利]一种核苷酸突变位点的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于基因组学和分子生物学中有机生物分子领域，尤其涉及核苷酸 突变位点的检测方法。

背景技术

自然界大多数生物体的遗传信息均包含在脱氧核糖核酸(DNA)中，人类 全基因组中30亿个碱基，约4万个基因，分布在24对染色体上。每个基因通 过转录、翻译，编码特异的蛋白质，调控生物体内特定的生化反应，发挥特异 的生物学功能。DNA序列的改变，即基因突变，会导致蛋白质结构、功能的改 变或缺失，进而引起相关的遗传疾病。基因突变包括DNA分子中发生碱基对 的插入、缺失和改变(点突变)。

研究表明许多疾病的发生，如血友病、地中海贫血、杜氏型肌营养不良、亨 廷顿舞蹈症、老年痴呆症、糖尿病、肥胖症、心血管疾病以及自身免疫等3000 多个疾病与基因突变密切相关。另外，近年来人们逐渐认识到癌症的发生发展 也是基因累积突变的结果。

在人类基因组中，约90％的差异是以单个核苷酸的差异体现出来的，主要 由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，这样的差异位点称作 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。在人群中，这种变异 的发生频率至少要大于1％，否则被认为是点突变。SNP位点大多数为双态， 即在一个位点上仅有两种表现形式，并且在人类基因组中广泛存在，平均每 500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。这些差 异极有可能是造成个体差异的遗传因素，因此发现这些位点可广泛地应用于遗 传标记的研究、评估个体遗传关系、评估物种进化等研究领域。

目前检测SNP和基因突变的方法有许多种，如直接PCR测序、RFLP、基 因芯片和荧光定量PCR等。其中，直接PCR测序最不敏感，只有耐药突变株 达到20％以上才能被检测到；也不适用于大规模筛选；RFLP分析只能检测出 在病毒总体中大于5％的突变株，但是对于每个感兴趣的突变，必须特别设计 单独的核酸内切酶。针对某些突变的特异性内切酶可能并不存在，RFLP分析 并不适用于所有的突变。基因芯片技术利用寡核苷酸微点阵，可以检测新发现的 突变，但这种方法代价昂贵，没有得到广泛应用。总之，上述这些方法不是费时 费力，灵敏度低，准确度低，就是成本高，不适合大规模筛查。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种核苷酸突变位点的检测方法，旨在解决 现有核苷酸突变位点的检测方法灵敏度低、准确性低的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种核苷酸突变位点的检测方法，包括如下 步骤：

一种核苷酸突变位点的检测方法，包括如下步骤：

(1)针对待检核苷酸序列可能存在的突变位点，并确定突变位点在待检序 列中的位置；

(2)根据突变位点的位置，设计3条引物，其中，一对为扩增引物，每条 引物长度至少30bp，其5’端各含10bp的tag；另一条为延伸引物，长度为 17-28bp，正好位于突变位点的5’端；

(3)通过PCR扩增，获得含有所述突变位点的靶序列扩增产物；

(4)通过SAP酶处理，除去所述扩增产物中含有的dNTPs；

(5)通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，且该碱基正好与 突变位点上的碱基互补，延伸反应所使用的原料是是以扩大分子量差异为目的 进行过质量修饰的四种ddNTP分子

(6)采用树脂纯化延伸反应产物；

(7)将纯化后的产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管， 然后用瞬时纳秒强激光激发进行质谱检测，确定突变的基因型。

与现有技术相比，上述技术方案，通过SAP酶(虾碱磷酸酶)处理，除去 所述扩增产物中含有的dNTPs，可以将未反应的dNTP去磷酸化，阻止其参与 到后续反应中，以确保延伸反应时只延伸一个碱基；延伸反应所使用的原料是 经过质量修饰的ddNTP，以增大四种ddNTP分子量差异，提高分辨率。将纯化 产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，然后用瞬时纳秒强激 光激发，由于基质分子经辐射吸收能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基 质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电 荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移 区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器。这样，采用质 谱仪检测待检测突变位点不仅方便，而且灵敏度高、准确性高。