[发明专利]环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌

说明书

技术领域：

本发明涉及一种环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌。

背景技术：

目前，对食源性致病菌的检测主要有标准方法、生化仪器法(API，VETEK)、 酶联荧光免疫检测法(VIDAS)、胶体金试纸法、PCR法、基因芯片法等。微 生物的传统检测方法除操作繁琐外，检验时间也较长，一般需要5-15天的培养 鉴定时间，时间上不能满足快速检测的要求。

随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的 不断发展，人们已创建了不少快速、简便、特异、敏感致病菌检测方法。免疫 学方法简单快速，但灵敏性差，假阳性高；分子生物学技术简单快速，灵敏度 高，但设备投入高，不易推广使用。

发明内容：

本发明的目的是提供一种检测方便、快捷的环介导恒温扩增方法检测单核 细胞增生李斯特菌。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其组成包括：预处理、 选择单核细胞增生李斯特菌的靶基因、检测过程、结果检测、结果判断，选择 单核细胞增生李斯特菌的靶基因(GenBank登陆号：AF532235)，设计2对引物：

内引物为：FIP：TTAGGCGCAGGTGTAGTTGC CTGCTGCAGAAACAAAAACTGAA

          BIP：GATCAAAATGCTACTACACACGCTG CCGTATTTTACGGATAAAGCCCA

外引物为：F3：ACACAAGAAGTGAAAAAAGAAAC

          B3：ACATAATGTCTTGAACAGAAACA

通过提供特异性的引物组，对单核细胞增生李斯特菌的核酸进行LAMP基因 扩增，检测样品中是否存在特定基因片段，进而确定样品中是否存在单核细胞 增生李斯特菌。

环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，其组成包括：预处理、 检测过程、结果检测、结果判断，所述的检测过程是将22.5μLLAMP反应液、 0.5μLBst酶，DNA(单核细胞增生李斯特菌)加入到洁净的1.5mL离心管中， 混合均匀，以2000r/min转速离心10sec，向一组反应管中分别加入22.5μL上 述反应液，向PCR反应管内按顺序分别加入阴性对照、待检模板和阳性对照 各2μL，盖紧管盖并做好标记，置65℃恒温反应60min。

所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所述的预处理是 将环介导恒温扩增LAMP反应液在使用前在室温融化振荡混匀后，以2000r/min 转速离心10sec，其余室温融化后，以2000r/min转速离心10sec。

所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所述的结果检测 是取出反应管，冷却至室温，以2000r/min转速离心10sec，观看是否有沉淀或 分别加入1μL显色液，轻轻混匀，在黑色背景下观察颜色变化或电泳检测。

所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所述的结果判断 在阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：待检样 品反应管液体呈绿色，该样品结果为单核增生李斯特氏菌阳性；待检样品反应 管液体呈橙色则可报告单核增生李斯特氏菌检验结果为阴性；若阴阳性对照反 应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。

所述的环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌，所需LAMP反应 管数的计算方法为：设LAMP反应管数为n，则n＝样品数+1(阳性对照)+1(阴 性对照)+1。

这个技术方案有以下有益效果：