[发明专利]双色单光子横向超分辨成像的方法和装置

权利要求书

1.一种双色单光子横向超分辨成像的方法，其特征是采用两束激光分别作为敏化光和激发光，利用聚焦后两束光的点扩散函数重叠部分同时敏化和激发被可逆光敏荧光蛋白分子标记的样品(4)，被激发的荧光信号通过陷波滤光片(14)和长通滤光片(15)过滤由聚焦透镜(16)聚焦，经过一个小孔光阑(17)滤除背景噪声被雪崩二极管(18)收集，计算机(19)记录荧光信号强度数值，接下来计算机(19)关闭快门(9)阻挡所述的激发光，使所述样品上的可逆荧光蛋白分子在敏化光的作用下恢复到可激发态，每测量完所述样品(4)的一个测量点后，计算机(19)驱动三维平移台(20)移动所述样品(4)至下一个待测量点，所述的快门(9)在计算机(19)的控制下再次打开，重复上述测量过程，计算机(19)依次获取所述样品(4)的所有测量点的荧光信号强度值，然后由计算机(20)根据所采集的所有测量点的荧光信号强度值按几何位置排列重构，获得所述的样品(4)的三维图像。

2.根据权利要求1所述的双色单光子横向超分辨成像的方法，其特征在于所述的激发光所产生的荧光与所述的敏化光强和激发光强的关系处于线性区。

3.一种实施权利要求1所述方法的双色单光子横向超分辨的成像装置，其特征在于该装置包括照明部分、探测收集部分和扫描部分：

照明部分包括：敏化光源(1)，沿该敏化光源(1)输出的敏化光束方向依次是敏化衰减片(5)、敏化准直系统(6)和敏化双色镜(8)，该敏化双色镜(8)与所述敏化光源(1)输出的敏化光束成45°放置；激发光源(2)，沿该激发光源(2)输出激发光束方向依次是快门(9)、激发衰减片(10)、激发准直系统(11)和激发双色镜(13)，该激发双色镜(13)与所述激发光源(2)输出的激发光束成45°放置；所述的敏化双色镜(8)与所述的激发双色镜(13)平行放置；所述的敏化光束和激发光束分别经过所述的敏化双色镜(8)和激发双色镜(13)反射后平行出射，所述的敏化光束和激发光束的光斑宽度略小于物镜(3)后表面的宽度，平行出射的敏化光束和激发光束经所述的物镜(3)聚焦后的点扩散函数重叠，中心相距为0，照明所述的被可逆光敏荧光蛋白分子标记的样品(4)；

探测收集部分由陷波滤光片(14)、长通滤光片(15)、聚焦透镜(16)、小孔光阑(17)、雪崩二极管(18)和计算机(19)组成，沿着经样品(4)发射的荧光方向，在所述的激发双色镜(13)之后，依次设置所述的陷波滤光片(14)、长通滤光片(15)、聚焦透镜(16)、小孔光阑(17)和雪崩二极管(18)，所述的小孔光阑(17)置于所述的聚焦透镜(16)的焦平面，中心对准焦点，所述的雪崩二极管(18)接收荧光信号后输入计算机(19)；

扫描部分包括供放置所述的样品(4)的三维平移台(20)，所述的计算机(19)驱动并控制所述的三维平移台(20)的移动和所述的快门(9)的开合，以实现对所述的样品(4)的扫描。

4.根据权利要求3所述的双色单光子横向超分辨的成像装置，其特征在于：在所述的敏化准直系统(6)和敏化双色镜(8)之间还有敏化光瞳滤波器(7)，在所述的激发准直系统(11)和激发双色镜(13)之间还有激发光瞳滤波器(12)。

5.根据权利要求4所述的双色单光子横向超分辨的成像装置，其特征在于所述的敏化光瞳滤波器(7)和所述的激发光瞳滤波器(11)为三区位相型光瞳滤波器，由内向外三区(A、B、C)位相依次为0、π、0，归一化半径依次为0.12∶0.6∶1。

6.根据权利要求3所述的双色单光子横向超分辨的成像装置，其特征在于所述的敏化光源(1)输出光束的波长为405nm，所述的激发光源(2)输出光束的波长为488nm。

7.根据权利要求3所述的双色单光子横向超分辨的成像装置，其特征在于所述的敏化双色镜(8)是对波长为405nm的光束高反，波长为488-550nm的光束高透的双色镜。

8.根据权利要求3所述的双色单光子横向超分辨的成像装置，其特征在于所述的激发双色镜(12)是对波长为488nm的光束高反，波长为500-550nm的光束高透的双色镜。

9.根据权利要求3至8任一项所述的双色单光子横向超分辨的成像装置，其特征在于所述的陷波滤光片(13)是对波长为488nm的光束高反，其它波长的光束高透的滤光片。

10.根据权利要求3至8任一项所述的双色单光子横向超分辨的成像装置，其特征在于所述的长通滤光片(14)是对波长为500nm以上的光束高透，500nm以下的光束高反的滤光片。