[发明专利]一种灵芝细胞固定化方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物细胞固定方法，具体地，涉及一种灵芝细胞固定化方法。

背景技术

灵芝(Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Krast.)属于担子菌纲、多孔菌科、灵芝属高等真菌。中华传统医学认为，灵芝味甘、性温、无毒、可补心、肝、肺、脾、肾五胀之气，具滋补强壮、固本扶正之功效。现代医学研究也表明，灵芝的药理成分非常丰富，其中有效成份包括多糖类(即：灵芝多糖)、三萜类(主要为灵芝酸类)、灵芝多肽、16种氨基酸(其中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、甾类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸(主含延胡索酸)，以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn、等。灵芝对人体具有双向调节作用，所治病种，涉及心脑血管、消化、神经、内分泌、呼吸、运动等各个系统，尤其对肿瘤、肝脏病变、失眠以及衰老的防治作用十分显著。其主要有效成份为灵芝多糖、灵芝酸具有抗癌和抗艾滋病等疗效(Russell R，Paterson M.(2006)Ganoderma-A therapeutic fungal biofactory.PHytochemistry67:1985-2001；Kun-Chieh Cheng，Hsuan-Cheng Huang，Jenn-Han Chen，et al.(2007)Ganoderma lucidum polysaccharides in human monocytic leukemia cells：from geneexpression to network construction.BMC Genomics.8：411.；El-MekkawyS，Meselhy MR，Nakamura N，Tezuka Y，Hattori M，Kakiuchi N，ShimotohnoK，Kawahata T，Otake T.(1998)Anti-HIV 1 and anti-HIV-1-protease substances fromGanoderma lucidum.PHytochemistry49：1651-1657)。

在灵芝多糖、灵芝酸的药用价值被广泛揭示的同时，灵芝产量和质量成为限制其应用的瓶颈。目前灵芝的主要来源一是采集野生灵芝，二是人工栽培。野生灵芝数量稀少，采集困难，价格高昂，难以广泛应用。人工栽培灵芝的生长期很短，先天不足，菌种抗病毒能力差，农药的大量使用，基料的变化等，使目前的人工栽培灵芝往往是有其形而无其实。

目前也发展了利用发酵方法产生灵芝多糖和灵芝酸等有效成份的方法，主要采用液体深层发酵。如公开号为CN1264743A(发明名称：液体发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝酸的工艺)、CN1375557A(发明名称：生物反应器中灵芝细胞两阶段培养生产灵芝酸的方法)、授权公告号为CN1141392C(发明名称：中间补料发酵生产灵芝多糖和灵芝酸的方法)、公开号为101235393A(发明名称：促进灵芝酸和灵芝多糖生物合成的发酵方法)等专利文献公开了一系列通过液体深层发酵产生灵芝多糖和灵芝酸的方法。但液体深层发酵是采用游离细胞生产灵芝糖和灵芝酸，细胞密度低，产物含量和产量低，这正是灵芝多糖和灵芝酸生产行业的瓶颈。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种灵芝细胞固定化方法，与游离细胞发酵相比，提高了细胞密度，增加了产物含量和产量，增强细胞耐受毒害能力，易于分离细胞和产物，可反复利用，发酵周期长。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种灵芝细胞固定化方法，包括以下步骤：

(1)固定化细胞载体的制备：取人造海绵或玉米芯或丝瓜瓤，洗净，在121℃灭菌45～60min，保存备用；

(2)灵芝细胞斜面的培养：无菌条件下，将灵芝细胞接种到斜面培养基上，在25～28℃培养7～9天，形成种子菌；

(3)种子菌扩大培养：在无菌条件下，收集种子菌，接种到装无菌培养液250～350ml的500ml三角瓶中或装无菌培养液1100～1400m的2000ml三角瓶中，在25～28℃下以100～130r/min摇瓶培养8～10天，形成菌液；

(4)用衡重法测定细胞干质量达到0.7～1.0mg/ml；

(5)按培养液体积与载体干质量的比例为8～10ml∶1～1.5mg，在无菌条件下向菌液中加入备用载体；

(6)以100～130r/min摇瓶培养8～12小时，细胞被固定。

本发明灵芝细胞固定化方法中，按衡重法测定细胞固定化效率为70～85％。